过氧化氢诱导斜带石斑鱼肝细胞氧化损伤的转录组学研究

发布时间：2020-08-26 12:14

【摘要】：1.H_2O_2诱导斜带石斑鱼肝细胞氧化损伤模型的建立通过不同的过氧化氢培养浓度(0、100、200、400、600、800、1000μmol/L)和作用时间(2、4、6、8、12、24 h)探索适宜的斜带石斑鱼肝细胞氧化损伤浓度和时间,以建立的斜带石斑鱼原代肝细胞氧化损伤模型,并检测培养过程中肝细胞的数量和活性的变化。采用单因子完全随机设计实验,根据台盼蓝对死细胞拒染法利用血球计数板测定细胞活力及数量,并通过MTT法测定细胞存活率。结果显示,800μmol/L H_2O_2,作用8 h,斜带石斑鱼肝细胞的存活率降低至61.98%。2.H_2O_2对斜带石斑鱼原代肝细胞活性及功能的影响本研究采用斜带石斑鱼原代肝细胞模型,主要探究过氧化氢对原代培养的肝细胞氧化损伤机制的影响。通过测定不同培养时间下过氧化氢不同作用浓度的肝细胞或培养上清液中的超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、脂质过氧化物(LPO)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)的变化,分析细胞生长代谢状态。结果显示,使用过氧化氢处理后其他各组与800μmol/L和1000μmol/L组相比显著降低了CAT、GSH-PX和SOD活性,显著升高LPO、MDA含量(P0.05),但是800和1000μmol/L组之间没有显著差异(P0.05)。结果发现:H_2O_2过氧化氢作用时间为8 h、作用浓度为800μmol/L,使斜带石斑鱼原代肝细胞产生了明显的氧化应激,该条件可作为建立斜带石斑鱼肝细胞氧化损伤模型的适宜条件。3.利用转录组学技术研究过氧化氢对肝细胞差异表达影响本研究以过氧化氢为刺激源诱导建立了斜带石斑鱼肝细胞氧化损伤模型,试验基于RNA-Seq技术对正常处理组(L-15)和对照组(800μmol/L H_2O_2)的斜带石斑鱼肝细胞进行测序,利用转录组学技术深度分析细胞内部基因的转录调控以及过氧化氢处理后细胞表型和功能的改变。结果显示,通过转录组数据分析发现,对83,802,103条原始reads的筛选和排除,拼接获得到了112,618条Unigenes,平均长度为957.45 bp,N50为1,687 bp。按照Blast等相关软件,对数据进行相关分析后,共得到功能注释基因110,560个。依据GO富集分析发现,差异表达基因主要被集中在代谢通路、细胞过程、生物调控等通路中,在KEGG pathway富集分析中结果显示,代谢通路涉及基因最多,有170个。两种水平下(过氧化氢处理组和对照组)共差异表达的基因共2,570个,其中上调的基因1,520个,下调的基因1,020个。结果显示,800μmol/L H_2O_2对斜带石斑鱼肝细胞的代谢和生物调控等相关基因表达产生影响。本实验对差异表达的基因进行后续分析及预测,为斜带石斑鱼生长代谢及疾病预防等方面的研究提供了丰富的数据来源。
【学位授予单位】：集美大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S917.4
【图文】：

还原过程,活性自由基,细胞内,信号因子

体内部环境持续位于氧化应激状态，最终导致细胞增生和凋亡异常[22-24]。ROS 号分子，参与调控细胞内多种氧化还原代谢反应，包括细胞应激效应、能量代答[25]。研究表明，物理和化学损伤因素均能导致生物体大量积存 ROS 和氧化动物体内其往往是导致细胞癌变的促进剂和启动剂[26]。O2是动物体内 ROS 的主要存在形式，过氧化氢通过代谢产生的活性氧离子，极膜并与铁离子结合形成更高活性自由基，从而诱发膜钙离子通道异常开放，离引起细胞凋亡。此外，不是所有的 ROS 形式(羟自由基、超氧阴离子等)都能发号应答功能。由于 H2O2代谢产生活性自由基有半衰期长、氧化还原电位较低小等突出特点，因此在细胞内可以较稳定的透过细胞膜扩散到其他细胞引起更这些特殊的理化特性决定了其在抗氧化研究中的重要性。研究还发现，动物细受浓度在不同物种间表现出高度的保守性(见图 1)[28]。此外，H2O2及其代谢产由几种定位于胞内不同区域的酶类产生或清除的 ROS，这表明胞内的 H2O2浓闭隔室”调控。简而言之，H2O2作为一种长效的小分子信号，可能是细胞重要的关键性调控信号因子[29, 30]。

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位论文过氧化氢诱导斜带石斑鱼肝细胞氧化损伤的转录组学酶复合体 I 和Ⅲ中“逃逸”出来，将分子细胞中的分子氧还原成超氧阴成强氧化性的 H2O2。在细胞中特定铁和铜复合物的反应下，H2O2被转更强的羟自由基( OH)[33, 34]。由此可知细胞内 ROS 的最初来源都是 O2 产生和清除受到严格调控。细胞中存在着多种有效的抗氧化防御机制，这对应的各种抗氧化酶来完成，主要有超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化还蛋白过氧化物酶(Prx)、谷胱甘肽还原酶(GR)、谷胱甘肽过氧化物酶(G氨酸连接酶(GCLC、GCLM)等[30]。这些酶定位于细胞内的各个区域来强活性氧的水平。(见图 2)

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硕士学位论文过氧化氢诱导斜带石斑鱼肝细胞氧化损伤的转录NA-Seq 技术优点年发展起来的基于基因组的转录组测序(RNA-Seq)即高通量测序技术[51]。、重复性高、可检测范围广以及定量准确等优点[52]。而且对所有物种都因组序列信息未知的物种也同样适用。例如利用 RNA-Seq 中 454 测序的 Vera 等人研究[53]。此外，对于已知基因组序列信息的这些 reads，在参上直接可以匹配到，随后对其进行拼接组装，或通过转录本的表达量来对于没有参考基因组的那些 reads 就必须进行 de novo 组装。如图 1-3 所

【参考文献】