间接ELISA检测林麝源铜绿假单胞菌抗体方法的建立及应用评估

发布时间：2020-10-18 19:38

　　 铜绿假单胞菌能引起林麝的化脓病,该病病程缓慢、不易发现,发现后也难以治愈,给人工养殖林麝造成巨大损失。本试验旨在建立一种特异性强、重复性好、灵敏度高的间接ELISA方法,为监测林麝体内的铜绿假单胞菌抗体水平,并为防控铜绿假单胞菌引起的林麝化脓性疾病提供帮助和指导。提取铜绿假单胞菌Sp-1株的外膜蛋白作为包被抗原。经SDS-PAGE分析,提取的外膜蛋白有7-10条带,分子量在15kDa～100kDa之间,是该菌的主要外膜蛋白。通过Western Blotting检测,发现该外膜蛋白有4条印迹条带,分子量分别是46 kDa、34kDa、25 kDa和19 kDa,可用作包被抗原。本试验建立的间接ELISA方法的最佳条件：外膜蛋白包被浓度为1.5 μg/ml;包被条件是37℃,温箱孵育4h；封闭条件为5%脱脂奶粉37℃作用2h；抗体稀释倍数为1000倍,抗体与抗原作用条件为37℃孵育1.5 h；HRP-SPA稀释倍数为64000倍,与抗体作用条件为37℃孵育1.5 h; TMB作用条件为37℃显色15 min。用建立的间接ELISA方法检测了大肠杆菌抗血清、沙门氏菌抗血清、不动杆菌抗血清和金黄色葡萄球菌抗血清,结果这四种菌的抗血清均判为铜绿假单胞菌抗体阴性；把Sp-1株阳性血清用外膜蛋白处理后进行检测,结果表明,与未处理组相比,处理组OD值显著降低,阻断率在63.69%～75.38%之间。经板间重复试验和板内重复试验进行重复性检测,变异系数在2%～10%之间。将本试验制备的铜绿假单胞菌Sp-1株阳性血清倍比稀释后进行检测,当稀释至32000倍时,其P/N值2,结果仍判为阳性。用该方法检测了30份经Sp-1株免疫后的小鼠血清,效价达到1：12500、1：2500、1：500和1：100的分别有13份、7份、2份和2份,低于1：100的有6份。同时,检测了2014年10月份和11月份采集的林麝血清样品32份,有4份血清判为阳性,其余判为阴性。本试验建立的检测林麝铜绿假单胞菌抗体的间接ELISA方法具有重复性好、特异性强和灵敏度高的优点,可用于林麝群体的抗体水平的监测,能够为制定合理的免疫程序提供理论依据和防控铜绿假单胞菌引起化脓性性疾病提供帮助和指导。
【学位单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S858.94
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 文献综述
    1.1 铜绿假单胞菌概述
        1.1.1 铜绿假单胞菌的病原学
        1.1.2 铜绿假单胞菌的危害
        1.1.3 外毒素A
        1.1.4 铜绿假单胞菌的外膜蛋白
        1.1.5 铜绿假单胞菌的分型
        1.1.6 铜绿假单胞菌的耐药性
    1.2 我国林麝养殖现状
    1.3 诊断方法
        1.3.1 细菌学检验
        1.3.2 分子学诊断
        1.3.3 血清学诊断
    1.4 铜绿假单胞菌病的防治
        1.4.1 预防
        1.4.2 治疗
    1.5 ELISA研究进展
    1.6 研究目的和意义
2 试验材料
    2.1 试验菌株与试验动物
    2.2 主要试剂
    2.3 主要仪器
    2.4 主要溶液及配制
        2.4.1 培养基等
        2.4.2 SDS-PAGE及Western Blotting涉及溶液
        2.4.3 ELISA涉及溶液
3 试验方法
    3.1 包被抗原和抗Sp-1株全菌血清
        3.1.1 包被抗原的制备
        3.1.2 抗Sp-1株全菌血清的制备
        3.1.3 林麝阴性血清的制备
    3.2 间接ELISA方法的建立
        3.2.1 间接ELSIA条件的优化
        3.2.2 特异性试验
        3.2.3 重复性试验
        3.2.4 灵敏度试验
        3.2.5 包被板保存期试验
    3.3 临床样品检测
        3.3.1 免疫后小鼠血清中铜绿假单胞菌抗体水平的检测
        3.3.2 林麝血清中铜绿假单胞菌抗体水平的检测
4 试验结果
    4.1 外膜蛋白与抗血清的制备与检测
        4.1.1 外膜蛋白浓度测定
        4.1.2 外膜蛋白SDS-PAGE电泳及Western Blotting结果
        4.1.3 抗血清双向琼扩检测结果
    4.2 间接ELISA方法的建立
        4.2.1 间接ELISA条件的优化
        4.2.2 特异性试验
        4.2.3 重复性试验
        4.2.4 灵敏度试验
        4.2.5 保存期试验
    4.3 临床样品检测
        4.3.1 免疫后小鼠血清中铜绿假单胞菌抗体水平的检测
        4.3.2 林麝血清中铜绿假单胞菌抗体的检测
5 讨论
    5.1 包被抗原和抗血清
        5.1.1 包被抗原的选择
        5.1.2 外膜蛋白的制备方法
        5.1.3 外膜蛋白
        5.1.4 免疫程序及抗血清的制备
    5.2 ELISA条件的选择
        5.2.1 酶标仪测定方法的选择
        5.2.2 外膜蛋白最佳包被浓度和血清最佳稀释度
        5.2.3 其它条件的选择
        5.2.4 保存期
    5.3 临床检测结果分析
6 结论
7 本论文的创新之处
参考文献
致谢

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本文编号：2846725