CRISPR/Cas9技术对绵羊肌肉卫星细胞MSTN基因的靶向敲除研究
发布时间：2021-03-09 04:44
CRISPR/Cas9技术是一种新型的基因组靶向修饰技术,可以对生物体基因组特异位点进行定点改造。能够高效的在靶位点产生DNA双链缺口（Double-strand breaks,DSB）。通过有错误倾向的非同源末端连接（Non-homologous end joining,NHEJ）机制修复,从而引入插入缺失突变。肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）是一类能够在骨骼肌中特异表达,并对骨骼肌的生长起到负调控作用的糖蛋白,又被称为生长分化因子-8（Growth differentiation factor-8,GDF-8）,属于转化生长因子-β（Transforming growth factor-β,TGF-β）超家族。MSTN基因的缺失或突变可引起动物出现“双肌”性状,促进动物肌肉的生长,提高产肉性能。利用CRISPR/Cas9技术制备MSTN基因敲除的绵羊肌卫星细胞,为制备MSTN基因敲除绵羊个体提供了材料。试验设计了4组特异靶向绵羊MSTN基因的靶位点,通过酶切连接的方法插入到CRISPR/Cas9骨架载体中并对其测序验证。通过酶消化法,分离培养了绵羊肌肉卫星细胞,在形态...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略表
第一章 文献综述
1.1 CRISPR/Cas系统的研究历程
1.2 CRISPR/Cas系统的结构与分类
1.3 CRISPR/Cas9的作用机理
1.4 CRISPR/Cas9靶位点选择及相关工具
1.5 CRISPR/Cas9的应用
1.5.1 在基因功能研究中的应用
1.5.2 在模式生物构建中的应用
1.5.3 在新品种改造和培育中的应用
1.5.4 在基因治疗中的应用
1.6 CRISPR/Cas9与ZFN和TALEN比较
1.7 CRISPR/Cas9技术存在的问题
1.8 研究展望
1.9 本研究的立题依据及研究内容
第二章 CRISPR/Cas9载体的构建与鉴定
2.1 引言
2.2 材料
2.2.1 主要试验材料
2.2.2 主要试验试剂
2.2.3 主要试验仪器设备
2.2.4 主要试验试剂的配制
2.3 试验方法
2.3.1 MSTN靶位点设计与合成
2.3.2 退火
2.3.3 pX330质粒的酶切
2.3.4 DNA胶回收
2.3.5 载体连接
2.3.6 pX330-target载体转化
2.3.7 阳性菌落的挑取与培养
2.3.8 质粒少量提取
2.3.9 质粒的鉴定
2.3.10 质粒大量提取
2.3.11 质粒浓度的测定
2.4 试验结果与分析
2.4.1 MSTN靶位点设计与合成
2.4.2 质粒的鉴定
2.4.3 质粒浓度的测定
2.5 讨论
第三章 绵羊原代肌卫星细胞的分离、培养及鉴定
3.1 引言
3.2 材料
3.2.1 主要试验材料
3.2.2 主要试验试剂
3.2.3 主要试验仪器设备
3.2.4 主要试验试剂的配制
3.3 试验方法
3.3.1 肌卫星细胞的分离纯化
3.3.2 肌卫星细胞的传代培养
3.3.3 肌卫星细胞的冻存与复苏
3.3.4 肌卫星细胞生长曲线的绘制
3.3.5 肌卫星细胞的诱导分化与HE细胞染色
3.3.6 肌卫星细胞总RNA的提取及逆转录
3.3.7 肌卫星细胞的鉴定
3.4 试验结果与分析
3.4.1 肌卫星细胞的分离培养
3.4.2 肌卫星细胞生长曲线的绘制与分析
3.4.3 肌卫星细胞的肌管诱导
3.4.4 肌卫星细胞总RNA的提取
3.4.5 肌卫星细胞的鉴定
3.5 讨论
第四章 CRISPR/Cas9载体转染肌卫星细胞及序列分析
4.1 引言
4.2 材料
4.2.1 主要试验材料
4.2.2 主要试验试剂
4.2.3 主要试验仪器设备
4.2.4 主要试验试剂的配制
4.3 试验方法
4.3.1 脂质体转染条件的优化
4.3.2 绵羊肌卫星细胞转染
4.3.3 CRISPR/Cas9打靶载体的活性检测
4.3.4 SURVEYOR检测靶位点突变率
4.3.5 极限稀释法制备单细胞克隆
4.3.6 MSTN基因突变细胞系的筛选和类型分析
4.4 试验结果与分析
4.4.1 脂质体转染条件的优化
4.4.2 CRISPR/Cas9打靶载体的活性检测
4.4.3 SURVEYOR检测靶位点突变率
4.4.4 单细胞克隆的制备及MSTN基因突变细胞系的筛选
4.5 讨论
第五章 全文结论
5.1 主要结论
5.2 创新点
5.3 后期计划
参考文献
致谢
作者简历
本文编号：3072270
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略表
第一章 文献综述
1.1 CRISPR/Cas系统的研究历程
1.2 CRISPR/Cas系统的结构与分类
1.3 CRISPR/Cas9的作用机理
1.4 CRISPR/Cas9靶位点选择及相关工具
1.5 CRISPR/Cas9的应用
1.5.1 在基因功能研究中的应用
1.5.2 在模式生物构建中的应用
1.5.3 在新品种改造和培育中的应用
1.5.4 在基因治疗中的应用
1.6 CRISPR/Cas9与ZFN和TALEN比较
1.7 CRISPR/Cas9技术存在的问题
1.8 研究展望
1.9 本研究的立题依据及研究内容
第二章 CRISPR/Cas9载体的构建与鉴定
2.1 引言
2.2 材料
2.2.1 主要试验材料
2.2.2 主要试验试剂
2.2.3 主要试验仪器设备
2.2.4 主要试验试剂的配制
2.3 试验方法
2.3.1 MSTN靶位点设计与合成
2.3.2 退火
2.3.3 pX330质粒的酶切
2.3.4 DNA胶回收
2.3.5 载体连接
2.3.6 pX330-target载体转化
2.3.7 阳性菌落的挑取与培养
2.3.8 质粒少量提取
2.3.9 质粒的鉴定
2.3.10 质粒大量提取
2.3.11 质粒浓度的测定
2.4 试验结果与分析
2.4.1 MSTN靶位点设计与合成
2.4.2 质粒的鉴定
2.4.3 质粒浓度的测定
2.5 讨论
第三章 绵羊原代肌卫星细胞的分离、培养及鉴定
3.1 引言
3.2 材料
3.2.1 主要试验材料
3.2.2 主要试验试剂
3.2.3 主要试验仪器设备
3.2.4 主要试验试剂的配制
3.3 试验方法
3.3.1 肌卫星细胞的分离纯化
3.3.2 肌卫星细胞的传代培养
3.3.3 肌卫星细胞的冻存与复苏
3.3.4 肌卫星细胞生长曲线的绘制
3.3.5 肌卫星细胞的诱导分化与HE细胞染色
3.3.6 肌卫星细胞总RNA的提取及逆转录
3.3.7 肌卫星细胞的鉴定
3.4 试验结果与分析
3.4.1 肌卫星细胞的分离培养
3.4.2 肌卫星细胞生长曲线的绘制与分析
3.4.3 肌卫星细胞的肌管诱导
3.4.4 肌卫星细胞总RNA的提取
3.4.5 肌卫星细胞的鉴定
3.5 讨论
第四章 CRISPR/Cas9载体转染肌卫星细胞及序列分析
4.1 引言
4.2 材料
4.2.1 主要试验材料
4.2.2 主要试验试剂
4.2.3 主要试验仪器设备
4.2.4 主要试验试剂的配制
4.3 试验方法
4.3.1 脂质体转染条件的优化
4.3.2 绵羊肌卫星细胞转染
4.3.3 CRISPR/Cas9打靶载体的活性检测
4.3.4 SURVEYOR检测靶位点突变率
4.3.5 极限稀释法制备单细胞克隆
4.3.6 MSTN基因突变细胞系的筛选和类型分析
4.4 试验结果与分析
4.4.1 脂质体转染条件的优化
4.4.2 CRISPR/Cas9打靶载体的活性检测
4.4.3 SURVEYOR检测靶位点突变率
4.4.4 单细胞克隆的制备及MSTN基因突变细胞系的筛选
4.5 讨论
第五章 全文结论
5.1 主要结论
5.2 创新点
5.3 后期计划
参考文献
致谢
作者简历
本文编号：3072270
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/zaizhiyanjiusheng/3072270.html
