马铃薯miR156靶向作用SPL基因调控侧根发育的机理研究
发布时间：2022-01-01 05:50
MicroRNAs（miRNAs）是一类内源性非编码小分子RNA,通常在转录后水平负调节靶基因表达,在植物生长发育的每个阶段都发挥着不可或缺的作用。miR156是一类进化上高度保守的miRNA家族之一,马铃薯Stu-miR156包含11个成员,调控靶基因SPL家族广泛参与植物的生长发育、激素应答、逆境胁迫响应和光合作用等代谢过程。但关于miR156对马铃薯生长发育和响应干旱胁迫的研究很少。本研究通过amiRNA技术和STTM技术构建马铃薯Stu-miR156过表达载体和沉默表达载体Stu-miR156STTM,转化马铃薯栽培品种“Desiree”获得转基因植株。qRT-PCR分析转基因植株中Stu-miR156及靶基因StSPL9的表达量,统计分析侧根数量及侧根长度,为进一步研究miR156/SPLs模块参与调控马铃薯侧根发育提供理论依据。本研究取得的主要结果如下:1.马铃薯Stu-miR156生物信息学分析表明有11条前体序列,加工形成16条成熟序列。通过靶基因在线预测工具psRNATarget发现靶基因StSPL9第1296-1316个碱基处被Stu-miR156靶向结合。2.构建...
【文章来源】：甘肃农业大学甘肃省
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
植物miRNA的生物合成（Parketal.,2002;Baumbergeretal.,2003）
甘肃农业大学2020届硕士学位论文6进一步研究发现，在IPS1与miR399成熟序列5’端互补配对结合的第10-11个碱基之间有三个碱基（CUA）的凸起，形成不完全互补结构。因此IPS1不能被miR399-RISC复合体的成熟发夹结构剪切，从而有效阻断miR399对IPS1RNA的切割，参与调控磷的动态平衡。Franco-Zorrilla等模拟miR399/IPS1的作用方式，设计并开发了miRNA的靶基因模拟序列（Targetmimicry,TM）技术[42]。短串联靶标模拟物（Shorttandemtargetmimic,STTM）技术是在TM技术的理论基础上，由Yan等[43]优化设计出的一种可以高效性和特异性降低miRNA的表达水平。可通过转化或基于病毒的瞬时表达系统将其引入植物中，同时有效阻断miRNA家族的所有成员，探索单个miRNA和多个miRNA间互相作用的功能成为可能[44]。STTM是模拟成熟miRNA茎环结构自身的骨架，设计出由一段特定的31、48和88个核苷酸的间隔子将两段miRNA的结合序列连接起来，从而形成茎环结构。大量试验证明，当间隔子为48个核苷酸时，对靶miRNA的表达量影响效果最明显。因此，48个核苷酸形成的茎环结构应用于STTM技术中。在这两个结合位点与靶标miRNA第10-11个碱基互补位点处有3个碱基（CTA）的凸起，这3个错配的碱基有效阻止miRNA与靶基因的完全互补结合，而不被RISC剪切。被STTM结合的目标miRNA可能被SDN降解，导致目标miRNA的沉默和靶基因的积累[45]。Yan就miR156/166-48nt设计出了如图1.2所示的STTM结构。图1.2STTM结构的工作模型（Yanetal.,2012；Tangetal.,2012）Fig.1.2theworkmodelofSTTMStructure（Yanetal.,2012;Tangetal.,2012）1.2.2STTM的研究进展为了更好研究miRNA的功能，自Yan等[43]在TM技术的基础上改良出STTM
甘肃农业大学2020届硕士学位论文8目前在拟南芥中已广泛研究了miR156-SPL调控网络的发育功能，发现有8个成员，其前体分别是miR156（a-h），在马铃薯中miR156有11个成员。在水稻中有19个SPL基因家族成员，其中有11个被miR156靶向[58]；拟南芥miR156靶向17个SPL家族中的11个基因[59]。根据其功能分为三类：（1）SPL2，SPL9，SPL10，SPL11，SPL13和SPL15主要调控从幼苗期到成熟期的过渡，其中SPL10在侧根起始位点表达，而SPL9在侧根分生组织区特异性表达并通过直接结合miR172b启动子调控miR172的表达，从而调控AGAMOUS-likeMADSboxprotein79(AGL79)转录因子参与抑制侧根的生长发育，并调控开花时间；（2）SPL3，SPL4和SPL5参与促进花的分生组织；（3）SPL6可能参与调节某些生理过程，但其确切功能仍未完全阐明[60]。在不同植物物种中，miR156调控SPL家族中的不同成员参与多种发育过程。如参与种子萌发和幼苗生长发育[61]、叶片和质体发育[61-63]、毛状体的形成和分布[64]、幼苗时期到花期和成熟期的阶段性过渡[65-69]、果实成熟[70]、谷物产量[71]甚至参与程序性细胞死亡（图1.3）[72]。图1.3miR156调控植物生长发育Fig.1.3miR156regulatesplantgrowthanddevelopment1.3.1miR156调控植物侧根发育植物根系的形态受到多种因素的调节，侧根是植物的重要农艺性状，具有吸收和运输养分和水分以及稳固植物的功能[73,74]。近年来研究发现侧根发育受磷胁迫、乙烯、生长素等因素的影响。miR156调控SPL基因抑制不定根的发≧育，
【参考文献】：
期刊论文
[1]Sl-miR482在番茄果实中的表达分析及STTM沉默载体的构建[J]. 莫显兰,史列琴,陆秋利,王小敏,任振新. 生物技术通报. 2019(12)
[2]玉米SBP转录因子全基因组鉴定与功能分析[J]. 彭华,何秀静,高健,罗茂,潘光堂,张志明. 作物学报. 2016(02)
[3]蛋白质亚细胞定位预测研究进展[J]. 郑珊珊,石卓兴,代琦,姚玉华. 科技视界. 2014(15)
[4]拟南芥miR172a-1/b-2/c对多种胁迫响应的研究[J]. 张文政,韩颖颖,严钦骅,明凤. 复旦学报(自然科学版). 2011(03)
[5]葡萄花发育基因的亚细胞定位和表达分析[J]. 杨光,曹雪,房经贵,黄振喜,陶建敏,王晨. 中国农业科学. 2011(03)
[6]SQUAMOSA Promoter-Binding Protein-Like Transcription Factors:Star Players for Plant Growth and Development[J]. Xiaobo Chen,Zenglin Zhang,Danmei Liu,Kai Zhang,Aili Li and Long Mao National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement (NFCRI),MOA Key Laboratory of Crop Germplasm & Biotechnology,Institute of Crop Science,Chinese Academy of Agricultural Sciences (CAAS),Beijing 100081,China. Journal of Integrative Plant Biology. 2010(11)
[7]植物蛋白质的亚细胞定位研究进展[J]. 邢浩然,刘丽娟,刘国振. 华北农学报. 2006(S2)
[8]Predicting Protein Subcellular Localization: Past, Present, and Future[J]. Pierre Dnnes,Annette Hglund. Genomics Proteomics & Bioinformatics. 2004(04)
博士论文
[1]马铃薯干旱相关microRNA的鉴定及功能研究[D]. 杨江伟.甘肃农业大学 2015
硕士论文
[1]马铃薯StWRKY57基因响应干旱胁迫的功能鉴定[D]. 陈馨.甘肃农业大学 2019
[2]利用STTM技术分析拟南芥miR160和miR165/166的互作网络及玉米miR166的初步功能[D]. 杨天啸.河南农业大学 2019
[3]STTM-OsmiRNA载体构建及水稻遗传转化[D]. 王钊辉.河南农业大学 2017
本文编号：3561746
【文章来源】：甘肃农业大学甘肃省
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
植物miRNA的生物合成（Parketal.,2002;Baumbergeretal.,2003）
甘肃农业大学2020届硕士学位论文6进一步研究发现，在IPS1与miR399成熟序列5’端互补配对结合的第10-11个碱基之间有三个碱基（CUA）的凸起，形成不完全互补结构。因此IPS1不能被miR399-RISC复合体的成熟发夹结构剪切，从而有效阻断miR399对IPS1RNA的切割，参与调控磷的动态平衡。Franco-Zorrilla等模拟miR399/IPS1的作用方式，设计并开发了miRNA的靶基因模拟序列（Targetmimicry,TM）技术[42]。短串联靶标模拟物（Shorttandemtargetmimic,STTM）技术是在TM技术的理论基础上，由Yan等[43]优化设计出的一种可以高效性和特异性降低miRNA的表达水平。可通过转化或基于病毒的瞬时表达系统将其引入植物中，同时有效阻断miRNA家族的所有成员，探索单个miRNA和多个miRNA间互相作用的功能成为可能[44]。STTM是模拟成熟miRNA茎环结构自身的骨架，设计出由一段特定的31、48和88个核苷酸的间隔子将两段miRNA的结合序列连接起来，从而形成茎环结构。大量试验证明，当间隔子为48个核苷酸时，对靶miRNA的表达量影响效果最明显。因此，48个核苷酸形成的茎环结构应用于STTM技术中。在这两个结合位点与靶标miRNA第10-11个碱基互补位点处有3个碱基（CTA）的凸起，这3个错配的碱基有效阻止miRNA与靶基因的完全互补结合，而不被RISC剪切。被STTM结合的目标miRNA可能被SDN降解，导致目标miRNA的沉默和靶基因的积累[45]。Yan就miR156/166-48nt设计出了如图1.2所示的STTM结构。图1.2STTM结构的工作模型（Yanetal.,2012；Tangetal.,2012）Fig.1.2theworkmodelofSTTMStructure（Yanetal.,2012;Tangetal.,2012）1.2.2STTM的研究进展为了更好研究miRNA的功能，自Yan等[43]在TM技术的基础上改良出STTM
甘肃农业大学2020届硕士学位论文8目前在拟南芥中已广泛研究了miR156-SPL调控网络的发育功能，发现有8个成员，其前体分别是miR156（a-h），在马铃薯中miR156有11个成员。在水稻中有19个SPL基因家族成员，其中有11个被miR156靶向[58]；拟南芥miR156靶向17个SPL家族中的11个基因[59]。根据其功能分为三类：（1）SPL2，SPL9，SPL10，SPL11，SPL13和SPL15主要调控从幼苗期到成熟期的过渡，其中SPL10在侧根起始位点表达，而SPL9在侧根分生组织区特异性表达并通过直接结合miR172b启动子调控miR172的表达，从而调控AGAMOUS-likeMADSboxprotein79(AGL79)转录因子参与抑制侧根的生长发育，并调控开花时间；（2）SPL3，SPL4和SPL5参与促进花的分生组织；（3）SPL6可能参与调节某些生理过程，但其确切功能仍未完全阐明[60]。在不同植物物种中，miR156调控SPL家族中的不同成员参与多种发育过程。如参与种子萌发和幼苗生长发育[61]、叶片和质体发育[61-63]、毛状体的形成和分布[64]、幼苗时期到花期和成熟期的阶段性过渡[65-69]、果实成熟[70]、谷物产量[71]甚至参与程序性细胞死亡（图1.3）[72]。图1.3miR156调控植物生长发育Fig.1.3miR156regulatesplantgrowthanddevelopment1.3.1miR156调控植物侧根发育植物根系的形态受到多种因素的调节，侧根是植物的重要农艺性状，具有吸收和运输养分和水分以及稳固植物的功能[73,74]。近年来研究发现侧根发育受磷胁迫、乙烯、生长素等因素的影响。miR156调控SPL基因抑制不定根的发≧育，
【参考文献】：
期刊论文
[1]Sl-miR482在番茄果实中的表达分析及STTM沉默载体的构建[J]. 莫显兰,史列琴,陆秋利,王小敏,任振新. 生物技术通报. 2019(12)
[2]玉米SBP转录因子全基因组鉴定与功能分析[J]. 彭华,何秀静,高健,罗茂,潘光堂,张志明. 作物学报. 2016(02)
[3]蛋白质亚细胞定位预测研究进展[J]. 郑珊珊,石卓兴,代琦,姚玉华. 科技视界. 2014(15)
[4]拟南芥miR172a-1/b-2/c对多种胁迫响应的研究[J]. 张文政,韩颖颖,严钦骅,明凤. 复旦学报(自然科学版). 2011(03)
[5]葡萄花发育基因的亚细胞定位和表达分析[J]. 杨光,曹雪,房经贵,黄振喜,陶建敏,王晨. 中国农业科学. 2011(03)
[6]SQUAMOSA Promoter-Binding Protein-Like Transcription Factors:Star Players for Plant Growth and Development[J]. Xiaobo Chen,Zenglin Zhang,Danmei Liu,Kai Zhang,Aili Li and Long Mao National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement (NFCRI),MOA Key Laboratory of Crop Germplasm & Biotechnology,Institute of Crop Science,Chinese Academy of Agricultural Sciences (CAAS),Beijing 100081,China. Journal of Integrative Plant Biology. 2010(11)
[7]植物蛋白质的亚细胞定位研究进展[J]. 邢浩然,刘丽娟,刘国振. 华北农学报. 2006(S2)
[8]Predicting Protein Subcellular Localization: Past, Present, and Future[J]. Pierre Dnnes,Annette Hglund. Genomics Proteomics & Bioinformatics. 2004(04)
博士论文
[1]马铃薯干旱相关microRNA的鉴定及功能研究[D]. 杨江伟.甘肃农业大学 2015
硕士论文
[1]马铃薯StWRKY57基因响应干旱胁迫的功能鉴定[D]. 陈馨.甘肃农业大学 2019
[2]利用STTM技术分析拟南芥miR160和miR165/166的互作网络及玉米miR166的初步功能[D]. 杨天啸.河南农业大学 2019
[3]STTM-OsmiRNA载体构建及水稻遗传转化[D]. 王钊辉.河南农业大学 2017
本文编号：3561746
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