异源PGIP蛋白抗水稻纹枯病分析及毒素降解菌筛选

发布时间：2023-06-28 04:42

　　立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)属丝核菌属(Rhizoctonia),根据菌丝融合情况被划分为14个融合群(anastomosis groups,AGs),即AG-1到AG-13和AG-BI,大多数类群为植物病原真菌,研究表明其主要致病因子为细胞壁降解酶和毒素。立枯丝核菌具有寄主范围广、危害大特性,每年因立枯丝核菌侵染所引起的水稻纹枯病造成水稻减产严重。目前,水稻种质资源中尚未发现对纹枯病完全免疫的抗性材料,也没有检测到稳定的主效数量性状基因座(quantitative trait locus,QTL),而且缺乏好的新的抗性基因资源。因此,本研究主要从两方面着手进行研究:对多个具有潜在抗真菌病害的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(polygalacturonase inhibiting protein,PGIP)基因进行克隆及分析,并通过转基因技术转化获得抗纹枯病水稻;对立枯丝核菌主要致病因子毒素进行提纯、活性分析及活性成分鉴定,并筛选了毒素降解菌和候选毒素降解酶。主要结果如下:1.分别从大豆、番茄和甜瓜等植物中克隆到8个不同PGIP基因:CucmPGIP1、Tri...

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【学位级别】：硕士

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致谢
摘要
Abstract
缩略词表
第一章 前言
    1 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(polygalacturonase inhibiting protein,PGIP)研究进展
        1.1 PGIP的结构
        1.2 PGIP的作用机制
        1.3 PGIP在植物抗病中应用
    2 立枯丝核菌毒素研究进展
        2.1 立枯丝核菌毒素提取工艺的发展
        2.2 立枯丝核菌毒素的成分鉴定
            2.2.1 羧酸及衍生物
            2.2.2 糖类及糖胺
        2.3 立枯丝核菌毒素的生物活性检测
            2.3.1 粗毒素混合物生物活性检测
            2.3.2 单一代谢物生物活性检测
        2.4 立枯丝核菌毒素的致病机理
            2.4.1 毒素对细胞破坏作用
            2.4.2 毒素对细胞膜的损伤作用
            2.4.3 毒素对寄主植物酶的影响
    3 本研究的目的和意义
第二章 不同植物PGIP基因克隆及序列测定
    1 材料与方法
        1.1 实验材料
            1.1.1 植物材料
            1.1.2 菌株和载体
            1.1.3 生化及分子生物学试剂
            1.1.4 主要实验仪器
            1.1.5 试剂及培养基的配制
        1.2 实验方法
            1.2.1 RNA提取
            1.2.2 cDNA合成
            1.2.3 PCR反应
            1.2.4 割胶回收
            1.2.5 连T载体
            1.2.6 转大肠杆菌
            1.2.7 挑单克隆验证及测序
            1.2.8 生物信息学分析
    2 结果与分析
        2.1 PGIP基因的克隆与序列分析
        2.2 PGIPs生物信息学分析
    3 结论与讨论
第三章 转PGIP基因水稻获得及对纹枯病抗性评价
    1 材料与方法
        1.1 实验材料
            1.1.1 植物材料
            1.1.2 菌株和载体
            1.1.3 生化及分子生物学试剂
            1.1.4 主要实验仪器
            1.1.5 试剂及培养基的配制
        1.2 实验方法
            1.2.1 PCR反应
            1.2.2 PGIP载体构建
            1.2.3 大肠杆菌感受态制备及转化
            1.2.4 阳性克隆鉴定
            1.2.5 质粒提取
            1.2.6 基因枪转化水稻
                1.2.6.1 水稻成熟胚愈伤组织的诱导
                1.2.6.2 金粉悬浮液制备
                1.2.6.3 基因枪轰击愈伤组织
                1.2.6.4 抗性愈伤组织的筛选及分化
                1.2.6.5 无菌苗的生根及移栽
            1.2.7 转基因植株PCR鉴定
                1.2.7.1 转基因植株DNA提取
                1.2.7.2 转基因植株的PCR鉴定
            1.2.8 转基因水稻抗纹枯病鉴定
    2 结果与分析
        2.1 目的基因获得
        2.2 阳性克隆鉴定
        2.3 转基因水稻的获得与验证
        2.4 转基因水稻抗水稻纹枯病鉴定
    3 结论与讨论
第四章 立枯丝核菌毒素提纯、活性分析及活性成分鉴定
    1 材料与方法
        1.1 实验材料
            1.1.1 植物材料
            1.1.2 供试菌株
            1.1.3 培养基与试剂
            1.1.4 PCR引物与测序
            1.1.5 供试仪器
        1.2 实验方法
            1.2.1 立枯丝核菌培养与纯化
            1.2.2 立枯丝核菌毒素的制备
            1.2.3 立枯丝核菌毒素组分分离与活性分析
                1.2.3.1 TLC定性分析
                1.2.3.2 毒素活性敏感度分析
                1.2.3.3 HPLC组分分离与活性分析
                1.2.3.4 活性组分LC-MS/MS分析
            1.2.4 毒素生物活性及稳定性分析
                1.2.4.1 毒素生物活性分析
                1.2.4.2 毒素稳定性分析
            1.2.5 毒素对不同植株叶片细胞膜损伤的测定
            1.2.6 毒素对不同植株叶片叶绿素含量影响的测定
            1.2.7 毒素对水稻根系活力的影响
            1.2.8 毒素对水稻防御酶的影响
                1.2.8.1 毒素对水稻PAL的影响
                1.2.8.2 毒素对水稻PPO的影响
                1.2.8.3 毒素对水稻POD的影响
    2 结果与分析
        2.1 毒素的制备
        2.2 立枯丝核菌毒素的组分分析
            2.2.1 TLC定性分析
            2.2.2 毒素活性敏感度分析
            2.2.3 HPLC分离活性组分
            2.2.4 活性组分LC-MS/MS分析
        2.3 胚根伸长抑制法测定毒素活性及稳定性
            2.3.1 毒素对水稻胚根伸长的抑制作用
            2.3.2 温度、化合物和酶对毒素活性影响
        2.4 毒素对不同植株细胞膜的损伤
        2.5 毒素对不同植株叶绿素含量的影响
        2.6 毒素对水稻根系活力的影响
        2.7 毒素对水稻防御酶的影响
    3 结论与讨论
第五章 降解毒素微生物的筛选及胞外蛋白分析
    1 材料与方法
        1.1 实验材料
            1.1.1 植物材料
            1.1.2 供试菌株和载体
            1.1.3 培养基与试剂
            1.1.4 引物与测序
            1.1.5 供试仪器
        1.2 方法
            1.2.1 毒素降解菌的筛选鉴定
            1.2.2 降解菌的抑菌活性
            1.2.3 胞外蛋白获取及生物活性分析
            1.2.4 胞外蛋白再分离及HPLC分析
            1.2.5 SDS-PAGE和蛋白质全谱分析
    2 结果与分析
        2.1 降解菌筛选鉴定
        2.2 降解菌的抑菌效果
        2.3 降解菌胞外蛋白获取及生物活性分析
        2.4 降解菌胞外蛋白液再分离及HPLC分析
        2.5 SDS-PAGE和蛋白质全谱分析
    3 结论与讨论
第六章 总结与展望
    1 全文总结
        1.1 不同植物PGIP基因克隆和序列分析
        1.2 转PGIP基因水稻获得及对纹枯病抗性评价
        1.3 立枯丝核菌毒素的分析
        1.4 毒素降解微生物筛选及蛋白酶分析
    2 问题与展望
参考文献



本文编号：3836000