小菜蛾过氧化物还原酶基因的鉴定及其功能研究

发布时间：2017-09-26 08:39

  本文关键词：小菜蛾过氧化物还原酶基因的鉴定及其功能研究

  更多相关文章： 小菜蛾 过氧化物还原酶 氧化压力 荧光定量PCR RNA干扰

【摘要】：过氧化物还原酶(Peroxiredoxins,Prxs)是广泛存在于真核生物和原核生物中的一个过氧化物酶超家族,其抗氧化作用对生物体是至关重要的。有关昆虫的Prx基因已有报道,但是小菜蛾的Prx基因家族还没有完整的研究报道。本研究克隆了小菜蛾的4个过氧化物还原酶基因分别为PxPrx1、PxPrx3、 PxPrx5、PxPrx6,其中PxPrx1、PxPrx3属于典型的2-Cys Prxs；PxPrx5属于非典型的2-Cys Prxs；PxPrx6属于1-Cys Prxs。进化树分析表明这4个基因与其他昆虫的Prx基因亲缘关系密切。本研究使用荧光定量PCR分析了PxPrx1、PxPrx3、PxPrx5和PxPrx6在小菜蛾不同发育阶段的表达水平,结果表明PxPrx1和Px Prx5均在蛹期和成虫期高表达：PxPrx3在幼虫期和成虫期高表达,而在蛹期低表达；PxPrx6在成虫期高表达。比较小菜蛾敏感品系、毒死蜱抗性品系和氟虫腈抗性品系3龄幼虫中4个Prx基因的表达量,除了PxPrx1在2个抗性品系中高表达外,其他3个基因并没有显著的差异性表达。比较小菜蛾马氏管、中肠、头部、表皮以及脂肪体中Prxs基因的相对表达量,发现PxPrx1、PxPrx6和PxPrx5在马氏管表达量高,PxPrx3在5个组织中的表达量无明显差异。比较4个Prx基因在小菜蛾龄期以及组织中的表达量,发现PxPrx6的表达量远低于其他3个基因,而其余3个基因的总体表达量相近。本研究还进行了小菜蛾冷、热、紫外(UV)照射、过氧化氢以及杀虫剂处理后,4个Prx基因的表达变化。选取特异性表达的基因PxPrx3和PxPrx5进行RNA干扰,结果表明基因的表达在24 h受到明显的抑制。用UV处理小菜蛾2h后,注射dsGFP组的PxPrx3的表达量都显著高于对照组和注射dsPxPrx3组;用热处理小菜蛾2h后,注射寸dsPxPrx3组的PxPrx3的表达量都显著高于对照组和注射dsGFP组。用UV处理小菜蛾2h后,注射dsGFP组的PxPrx5的表达量显著低于对照组；用热处理小菜蛾2h后,注射dsGFP组的PxPrx5的表达量显著低于对照组。由此可见,PxPrxs能够在一定程度上保护小菜蛾免受氧化损伤,但PxPrxs的转录调控水平是多样的,取决于PxPrx s的类型和压力的强度。
【关键词】：小菜蛾 过氧化物还原酶 氧化压力 荧光定量PCR RNA干扰
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S433.4
【目录】：

• 摘要8-10
• Abstract10-12
• 1 前言12-18
• 1.1 小菜蛾的危害性12
• 1.2 过氧化物还原酶的发现与分类12-14
• 1.3 过氧化物还原酶的抗氧化机制14-15
• 1.4 昆虫中过氧化物还原酶序列的特性15-16
• 1.5 昆虫过氧化物还原酶基因的功能研究16-18
• 1.5.1 过氧化物还原酶存在的部位及其角色16-17
• 1.5.2 过氧化物还原酶基因的应激表达17-18
• 2 材料与方法18-28
• 2.1 供试虫源18
• 2.2 主要试剂18
• 2.3 主要仪器18-19
• 2.4 试验方法19-20
• 2.4.1 小菜蛾总RNA的提取19-20
• 2.4.2 合成cDNA20
• 2.5 PCR产物回收、克隆与测序20-23
• 2.5.1 PCR及产物回收20-22
• 2.5.2 目的片段与T载体连接与转化22-23
• 2.5.2.1 制备感受态细胞22
• 2.5.2.2 连接和转化22-23
• 2.6 小菜蛾与其他昆虫的过氧化物还原酶进化树分析23-24
• 2.7 小菜蛾过氧化物还原酶基因的表达谱分析24
• 2.8 不同发育阶段、组织及不同胁迫下小菜蛾过氧化物还原酶基因的表达量测定24-26
• 2.8.1 小菜蛾不同龄期样品收集24
• 2.8.2 小菜蛾不同组织样品收集24
• 2.8.3 不同环境因子胁迫下小菜蛾过氧化物还原酶基因应激表达量的测定24-26
• 2.8.3.1 温度处理24-25
• 2.8.3.2 紫外线(UV)照射处理25
• 2.8.3.3 过氧化氢(H_2O_2)处理25
• 2.8.3.4 杀虫剂处理25-26
• 2.9 挑选特异性表达的小菜蛾过氧化物还原酶基因进行RNA干扰26-27
• 2.10 荧光定量PCR测定小菜蛾过氧化物还原酶基因相对的表达量27
• 2.11 数据分析27-28
• 3 结果与分析28-45
• 3.1 小菜蛾过氧化物还原酶基因全长cDNA的克隆与分析28-32
• 3.1.1 PxPrx1全长cDNA的克隆28-29
• 3.1.2 PxPrx3全长cDNA的克隆29-30
• 3.1.3 PxPrx5全长cDNA的克隆30-31
• 3.1.4 PxPrx6全长cDNA的克隆31-32
• 3.2 小菜蛾与其他昆虫过氧化物还原酶的同源性分析32-34
• 3.3 小菜蛾过氧化物还原酶基因的表达谱分析34-35
• 3.4 小菜蛾过氧化物还原酶基因在不同发育阶段、不同品系的表达量分析35-36
• 3.5 小菜蛾过氧化物还原酶基因在不同组织的表达量分析36-37
• 3.6 不同环境因子胁迫下小菜蛾过氧化物还原酶基因应激表达量的测定37-43
• 3.6.1 温度处理37-40
• 3.6.1.1 冷处理37-38
• 3.6.1.2 室温(25℃)对照组38-39
• 3.6.1.3 热处理39-40
• 3.6.2 紫外(UV)照射处理40-41
• 3.6.3 过氧化氢(H_2O_2)处理41-42
• 3.6.4 杀虫剂处理42-43
• 3.7 RNA干扰后小菜蛾过氧化物还原酶基因表达变化43-45
• 3.7.1 RNA干扰PxPrx343-44
• 3.7.2 RNA干扰PxPrx544-45
• 4 总结与讨论45-48
• 参考文献48-53
• 附录 基因克隆中PCR反应条件53-54
• 致谢54

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