拟南芥响应低温的分子遗传学机制分析

发布时间：2016-10-23 08:25

第一章   文献综述

冷胁迫会严重的影响叶绿体的功能，对不同种类植物的光合作用造成不同程度的影响  (Holaday et al., 1992; Somersalo and Krause, 1990; Streb et al., 1997)，导致下游碳的吸收及转运受阻。然而对于抗冷植物，如拟南芥  (Strand et al., 1999, 2003)  和一些越冬作物  (Hurry et al., 1994, 1995; Sagisaka et al., 1991)，它们在低温条件下生长数周之后仍然能够恢复光合作用和碳的转运  (Lundmark  et  al., 2006)。对于长期在低温条件下生长的草本植物来说，这种恢复光合作用的能力是必不可少的  (Ensminger et al., 2006; Stitt and Hurry, 2002)。所以叶绿体作为高等植物光合作用的场所，它们在低温条件下正常的发育和运转对植物抗冻性尤为重要。在筛选到的 16 个基因中，有 4 个属于叶绿体 RNA-binding 蛋白，其中 3 个已有相关报道，。ORRM1 参与拟南芥和玉米中质体 RNA 的编辑，但是并没有冷胁迫相关的研究；CP29A 和 CP31A 的突变体表现出冷敏感表型，它们调节拟南芥叶绿体转录物的表达和加工。另外一个 RNA-binding 蛋白基因，AT1G70200 还没有被研究过，我们给它命名为 RBD1。本研究主要针对 RBD1，着重分析 RBD1对叶绿体 RNA 的调节作用，希望能为进一步了解 RNP 在冷胁迫中的作用机制以及植物低温适应性机制奠定基础。

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第二章   拟南芥 rbd1 突变体冷敏感表型分析

2.1   材料和方法

为了更加深入的了解植物的抗冷机制，朱健康老师课题组从拟南芥生物技术中心  (Arabidopsis  Biological  Resource Center)订购了 11,000 个 T-DNA 插入突变体，这些突变体涵盖了拟南芥基因组将近一半的基因。白戈博士对这些突变体进行了冷敏感表型筛选  (Wang et al., 2016)，具体流程见图 2.1。总共筛选到 52 个具有冷敏感表型的突变体，涉及到 49 个基因。其中有 16 个基因编码的蛋白定位于叶绿体（附表 2.1，Unpublished data），这也进一步说明叶绿体功能在冷胁迫中的重要性.在这 16 个基因当中有 5 个基因编码叶绿体 RNA 结合蛋白  (cpRNP)。在冷胁迫条件下，它们均表现出冷敏感的黄化表型。因此，，在接下来的研究中我将对这 5 个 RNP 突变体一起进行冷敏感表型分析。

2.2   结果与分析

然后，为了进一步确定观察到的冷敏感表型是否确实是由于 RBD1 缺失引起的，我们还克隆了RBD1 的 cDNA，分别构建 p35S::RBD1 和 RBD1-RNAi 植物表达载体，并分别转化 rbd1 突变体和 Col-0 野生型植株。在 22°C 正常生长条件下，rbd1-1，rbd1-2，RBD1-RNAi 以及 RBD1 过表达转基因植株与 Col-0 野生型相比没有明显表型上的差异，只是 rbd1-1 和 rbd1-2 突变体叶片轻微发黄  (图 2.3D)。但是 22°C 正常条件下生长三周的拟南芥经过 4°C 冷处理两周之后，rbd1-1、rbd1-2 和RBD1-RNAi 植株的新生叶均开始表现出黄化的表型，四周时更为明显  (图 2.3D)。如果我们将黄化的植物重新转移到正常生长条件下，仅需要两天黄化的新叶就会重新变绿  (图 2.3E)。此外，由于我们观察到即使在 22°C 正常生长条件下，rbd1-1和 rbd1-2 突变体的叶片也会轻微发黄，所以测量其叶绿素含量，发现 rbd1-1 和rbd1-2 突变体叶绿素含量确实显著降低，而互补株系则和野生型 Col-0 没有差异 (图 2.3F)。以上结果表明：RBD1 缺失影响叶绿体功能，尤其在冷胁迫条件下可导致叶片黄化。

第三章   RBD1 基因表达及定位................ 39 

3.1   材料和方法 ..............39
3.2   结果与分析.............42
3.3   讨论 ..........................45 
3.4   小结 .....................46 
第四章   缺失 RBD1 影响叶绿体 23S rRNA 加工和翻译 ................... 47 
4.1   材料和方法..........47
4.2   结果与分析 ..........50
4.3   讨论 ...............................62 
4.4   小结 .............................65 
第五章   结论 ............. 67

第四章   tZ-type Cytokinin 调节植物免疫力

4.1   材料和方法

对以上植物接种 Pst DC3000 菌株，分别在接种完 0 天和 3 天时检测植株中细菌的浓度。0 天时它们之间并没有明显差异。接种 3 天后，喷洒 tZ-type 细胞分裂素的植物相对于喷洒空白对照和 iP-type 细胞分裂素的植物其免疫力都有显著性增强，尤其是 abcg14-3snc1-1 的免疫水平几乎达到 snc1-1 的水平  (图 4.3B)。这说明，tZ-type 细胞分裂素不仅可以恢复 abcg14-3snc1-1 的免疫力，还能增强植物的免疫力。 发现在 22°C 和 28°C条件下，外源喷洒 tZ-type 细胞分裂素可以恢复 abcg14-3 单突变体的所有生长表型缺陷，这说明 abcg14-3 单突变体的生长表型缺陷确实是由于缺乏 tZ-type 细胞分裂素造成的。但 abcg14-3snc1-1 双突变体的株型大小在 22°C 条件下并没有得到恢复，仅在 28°C 条件下得到部分恢复，而 abcg14-3snc1-1 双突变体的其它生长表型缺陷在 22°C 和 28°C 条件下都得到了恢复，如晚花，种子大小等。此外，我们意外的发现在22°C条件下喷洒tZ-type细胞分裂素使snc1-1单突变体变得更小，而且出现水渍化的表型，这些都是免疫力增强的表现。因此，  tZ-type 细胞分裂素对植物的生长有两个方面的影响：第一，tZ-type 细胞分裂素影响植物的生长发育；第二，tZ-type 细胞分裂素影响植物的免疫反应。但是 tZ-type 细胞分裂素介导的生长发育调节和植物免疫所影响的生长发育可能是两个相互独立的过程。 

4.2   结果与分析

为了进一步验证 abcg14-3snc1-1 的表型缺陷是否是由于缺乏 tZ-type 细胞分裂素造成的，我们在 22°C 生长条件下对野生型 Col-0、snc1-1、abcg14-3 和abcg14-3snc1-1 喷洒 10μm 的 tZ-type 细胞分裂素。abcg14-3 在正常生长条件下表现出矮小的株型，但如果每天喷洒 10μm 的 tZ-type 细胞分裂素则可以恢复abcg14-3 的生长缺陷，使其表型与野生型 Col-0 相似  (图 4.1A)。这说明 abcg14-3的生长缺陷确实是由于缺乏 tZ-type 细胞分裂素引起的。可令人费解的是，同样每天喷洒10μm的tZ-type细胞分裂素却无法恢复abcg14-3snc1-1的生长缺陷  (图4.1A)。经过仔细观察，我们发现即便是 snc1-1 经过喷洒后，植株也会变小并伴随水渍化  (图 4.1A)，这是免疫力增强的表现。因此,我们推测可能由于 snc1-1在 22°C 本身就具有很强的免疫反应，abcg14-3snc1-1 在喷洒完 10μm 的 tZ-type细胞分裂素之后，可能首先恢复其免疫力，然后又进一步增强，所以abcg14-3snc1-1 在喷洒完 10μm 的 tZ-type 细胞分裂素之后并没有表现出变大的生长表型。
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第五章   结论 

1. int211 增强 snc1-1 的生长缺陷，降低其免疫水平。 2. INT211 是一个 tZ-type 细胞分裂素转运体基因 ABCG14。 3. ABCG14 调节 SNC1 介导的免疫反应。 4. ABCG14 调节植物生长发育。 5. tZ-type 细胞分裂素调节植物免疫力。

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参考文献（略）

本文编号：150160