小型猪复合麻醉剂及其颉颃剂对大鼠不同脑区4EBP1基因及蛋白表达的影响

发布时间：2016-11-22 16:57

1 引言 

麻醉（Anesthesia）一词源自于希腊语（Anaisthaesia）。麻醉是由于药物的注射、口服或者其他有效方法对中枢神经或周围神经系统的可逆性的功能抑制。中国早在东汉时期就对麻醉有着一定的研究，现代医学第一次记载运用麻醉技术的是 1842 年 3 月 30 日的美国 Crawdord Williamson  Long 医生，他在帮他夫人接生的时候首次采用的麻醉药。随着麻醉技术的发展，即给数千万的病人带来大量的好处，但是麻醉的机理以及作用机制，是如何发挥作用的，至今仍然无法解释清楚。 随着近年来经过大量的国内外实验表明，小型猪和人在比较医学上同源关系较近，，解剖生理结构相近[1]。所以在医学、生命科学中小型猪是非常理想的动物模型。然而在实际操作过程中，国内并没有一款针对小型猪专用的全身麻醉剂。东北农业大学动物医学学院外科教研室麻醉课题组成功研制出小型猪复合麻醉剂（XFM）以及小型猪复合麻醉剂颉颃剂。由东北农业大学外科实验室前期研究结果表明 XFM 对小型猪麻醉诱导迅速，效果确实；小型猪特异性麻醉颉颃剂催醒效果确实，催醒迅速，无复睡现象，安全稳定[2]。 随着麻醉技术的发展与进步，麻醉界对麻醉的机制有着许多不同的看法，但是大多数已经被摒弃。大量的实验以及数据表明，Franks  NP 和 Lie  WR 的“蛋白质学说”为今天的全麻机制奠定了基础。 

1.1 麻醉概述
麻醉界认为，麻醉是由药物或者其他方法使中枢神经（或）周围神经系统的可逆性功能抑制，这种抑制可以使感觉特别是痛觉全部丧失或者部分丧失[3]。这种概念说明：麻醉是一种人为的可逆性的生理过程，在这个过程中，机体可以对外界感觉全部丧失或者部分丧失以及肌肉的张力减弱或者消失。这个过程时长可以可控制，并且可逆。机体内的麻醉药物被相应的颉颃剂、代谢或者排出后，机体便可逐渐恢复正常水平。良好的麻醉是外科手术以及相应处理的保障，妥善的麻醉可以简化保定方法，节省人力以及器械的支出；肌肉松弛性良好，使手术顺利的进行；避免手术以及相应的处置对机体中枢神经的刺激导致疼痛休克；手术以及相应的处置过程中避免机体产生意外损伤。所以，良好的麻醉需要达到充分的镇静、镇痛、肌松以及安定的效果，并且保证因为麻醉所导致的不良副为作用最小的程度[4]。
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1.2 麻醉药在中枢神经系统各个部位的作用 
中枢神经系统（Central Nervous System）是由动物所有脑组织以和脊髓组成的，是机体神经组织最集中的部位。中枢神经系统可以接受全身各个地方的传入的信息，以及时间和空间的信息，经过中枢神经系统整加工整合后，使神经元之间在机体的机能上产生突触联系。中枢神经系统可以将传入的信息学习，储存或发出兴奋、抑制等信号。麻醉药物达到镇痛、镇静、肌松或者失去意识的作用就是通过抑制中枢神经系统信号的传递来实现的。全身麻醉对于神经中枢系统的干预是非常强烈的，从而使机体出现感觉上暂时消失、意识的消失以及良好的肌肉松弛效果[9]。哺乳动物有着相对发达的大脑皮层，随着中枢神经系统的不断进化和完善，大脑皮层也进化的更为迅速。大脑皮层是调节躯体运动、调节机体与外界环境的平衡、信息的整合、储存和检索的主要部位，也就是说大脑皮层是维持机体正常活动的基础。然而中枢神经系统有着复杂的结构，全麻药是如何对大脑皮层产生作用的，至今麻醉界仍然没有一个明确的答案，随着各种方法以及技术对其的研究，脑电图（electroencephalogram，EEG）明确的记录了在机体注射全麻药后大脑皮层 EEG 的变化。杨同涛[10-11]等人证实了小型猪静脉注射乳化异氟醚后，EEG 的变化显示出乳化异氟醚可以使小型猪达到镇痛、镇静和肌松等效果良好的麻醉深度，随着麻醉深度的变化，EEG 的波形图也随着变化。张志龙[12]等人研究出动态观察氯胺酮对大鼠大脑皮层Na+，K+-ATP 以及 Ca2+-ATP 酶的活性影响，大鼠在注射氯胺酮后 Na+，K+-ATP 以及 Ca2+-ATP酶的活性被抑制，随之推断大脑皮层可能为氯胺酮在中枢神经的作用部位。侯金龙等人[13]研究后表明注射乳化异氟醚后的大鼠，大脑皮层的 n ACh Rs 的表达被抑制。 
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2 实验材料与方法 

2.1 实验材料
雌雄各半，选取购买自哈尔滨市医科大学动物实验中心的体重均在 220g-240g 的 90只 SD 大鼠。 
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2.2 实验方法

将体重为 220-240g 的 90 只 SD 大鼠（雌雄各半），放置于安静且舒适的环境饲养，不人工强制喂食饮水，光照适宜，一周后进行随机实验分组：分为 XFM 麻醉组（M 组）、小型猪复合麻醉颉颃剂组（J 组）、XFM 与颉颃剂交互组（MJ 组）；其中 M 组分为 5 个亚组（各亚组 6只）：  M1 组、M2 组、M3 组和 M4 组，M 组对照组为生理盐水对照组 C1 组；J 组根据注射颉颃剂后的时长分为 5 个亚组（各亚组 6 只）：  J1 组、J2 组和 J3 组和 J4 组，J 组对照组为生理盐水对照组 C2 组；MJ 组则分为 5 个亚组（各亚组 6 只）：  MJ1 组、MJ2 组、MJ3 组和 MJ4 组，MJ 组对照组为生理盐水对照组 C3 组。下图 2-1 为具体分组情况。 M 组中各亚组（C1 组除外）分别于腹腔注射 XFM 进行麻醉，其中 M1 组于注射 XFM 10min 后立即断颈处死并取脑，将取出的脑组织立即放置在无 RNA 酶的纱布并放置在冰块上；M2 组于注射 XFM  20min 后立即断颈处死并取脑，将取出的脑组织立即放置在无 RNA 酶的纱布并放置在冰块上；M3 组于注射 XFM  40min 后立即断颈处死并取脑，将取出的脑组织立即放置在无 RNA 酶的纱布并放置在冰块上；M4 组则于注射 XFM  60.0min 后立即断颈处死并取脑，将取出的脑组织立即放置在无 RNA 酶的纱布并放置在冰块上；而 C1 组腹腔注射与 XFM 麻醉剂量等量的生理盐水，待大鼠静置恢复平静后立即断颈处死并取脑，将取出的脑组织立即放置在无 RNA 酶的纱布并放置在冰块上。 J 组各亚组（C2 组除外）分别于腹腔注射 XFM 复合颉颃剂，J1 组于注射颉颃剂 10min 后立即断颈处死并取脑，将取出的脑组织立即放置在无 RNA 酶的纱布并放置在冰块上；J2 组于注射颉颃剂 20min 后立即断颈处死并取脑，将取出的脑组织立即放置在无 RNA 酶的纱布并放置在冰块上；J3 组于注射颉颃剂 40min 后立即断颈处死并取脑，将取出的脑组织立即放置在无 RNA酶的纱布并放置在冰块上；J4 组于注射颉颃剂后 60min 后立即断颈处死并取脑，将取出的脑组织立即放置在无 RNA 酶的纱布并放置在冰块上；C2 组注射与颉颃剂相同剂量的生理盐水，待大鼠恢复平静后立即断颈处死并取脑，将取出的脑组织立即放置在无 RNA 酶的纱布并放置在冰块上。 

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3  实验结果 ......... 20 
3.1 XFM 及其颉颃剂对大鼠不同脑区 4Ebp1 m RNA 含量的测定 ......... 20 
3.2 XFM 及其颉颃剂对大鼠不同脑区 4Ebp1 和 p-4Ebp1 蛋白含量的测定 .......... 26 
3.2.1  免疫印迹结果 ..... 26 
3.2.2 XFM 对大鼠不同脑区 4Ebp1 蛋白含量的测定 .......... 27 
3.2.3 XFM 对大鼠不同脑区 P-4Ebp1 蛋白含量的测定 ....... 28 
3.2.4  小型猪复合麻醉颉颃剂对大鼠不同脑区 4Ebp1 蛋白含量的测定 .... 30 
3.2.5  小型猪复合麻醉颉颃剂对大鼠不同脑区 p-4Ebp1 蛋白含量的测定 ......... 32 
3.2.6 XFM 及其复合麻醉颉颃剂交互作用对大鼠不同脑区 4Ebp1 蛋白含量的测定 ......... 33 
3.2.7 XFM 及其复合麻醉颉颃剂交互作用对大鼠不同脑区 p-4Ebp1 蛋白含量的测定 ........ 35 
4  讨论......... 37 
4.1  试验设计总体思路 ........... 37 
4.2  试验因素的控制 ....... 37 
4.3 XFM 及其颉颃剂与 4Ebp1 m RNA 转录的影响 ........ 38 
4.4 XFM 及其颉颃剂与 4Ebp1  蛋白表达的影响 ........... 39 
4.5 XFM 及其颉颃剂与 p-4Ebp1  蛋白表达的影响 ........ 40 
4.6  全身麻醉与催醒过程中 4Ebp1 作用机制探讨 ......... 40 
5  结论......... 42 

4 讨论 

4.1 试验设计总体思路 
由于在国内目前并没有一款真正适合小型猪的麻醉方法，东北农业大学外科教研室麻醉课题组通过大量的实验研究，逐渐克服了这一难题，成功研制出专用于小型猪的复合麻醉剂，主要成分由噻环已胺、赛拉嗪、强痛灵等组成的小型猪复合麻醉剂，即 XFM。经过本课题组大量的实验研究表明，小型猪复合麻醉剂对小型猪的呼吸系统、循环系统基本无副作用，对肝功、肾功的影响较小。用过临床实践表明，XFM 对于小型猪的肌松、镇痛、镇静效果良好，完全能够支持手术的顺利完成、以及对科学研究的需要[61-63]。 但是，所有的麻醉剂的研发都需要一款相对应的颉颃剂为其的麻醉安全护航，凭借有效的颉颃剂为特异性麻醉剂的麻醉程度进行操控。为了更好的推广小型猪复合麻醉剂(XFM)东北农业大学外科教研室成功研制出小型猪复合麻醉剂特异性颉颃剂，在成功麻醉小猪后为其生命安全保驾护航。特异性颉颃剂的研制成功意味着，高端科技研究的成功率以及准确性得到极大的提高。 然而小型猪复合麻醉剂是通过中枢神经系统发挥作用，但是具体的作用位点、发挥作用的途径至今仍然困扰着科研工作者们。之前东北农业大学外科教研室研究发现了 XFM 麻醉小型猪可以抑制特定脑区的 Na+，K+-ATP 以及 Ca2+-ATP 酶的活性，[12]以及 c AMP 信号转导系统被激活[22]，为了进一步从根本上找到 XFM 的作用的途径以及作用位点，本实验从与麻醉、增值有着密切联系的 m TOR 通路中的重要下游因子 4Ebp1 进行研究。4Ebp1 广泛存在于背部神经元的胶质细胞中，在周围细胞发炎的同时，其可以大量增值各种活化因子，可以促进疼痛敏感。在大鼠注射 XFM 及颉颃剂后，通过从基因以及蛋白两个水平对 4Ebp1 的表达水平进行研究，为研究XFM 及颉颃剂的麻醉以及催醒机制奠定了基础。
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结论 

（1）小型猪复合麻醉剂麻醉作用与大鼠脑内的大脑、海马、丘脑、小脑、脑干中的 4Ebp1 m RNA 及其蛋白、p-4Ebp1 蛋白的相对表达量有关，4Ebp1 因子可能是 XFM 在大鼠大脑中参与麻醉作用的表达位点之一； 
（2）小型猪复合麻醉颉颃剂颉颃作用与大鼠脑内的大脑、海马、丘脑、小脑、脑干中的4Ebp1  m RNA 及其蛋白、p-4Ebp1 蛋白的相对表达量有关，4Ebp1 因子可能是小型猪复合麻醉颉颃剂在大鼠大脑中参与催醒作用的表达位点之一； 
（3）小型猪复合麻醉颉颃剂并不能完全逆转 XFM 对 4Ebp1 的 m RNA、蛋白、磷酸化蛋白的影响，说明还有其他相关的通路或者受体参与着麻醉与催醒的作用，提示全麻机理研究的复杂性和多位点性。  
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参考文献(略)

本文编号：186206