黑龙江省部分地区绵羊三种肠道原虫基因分型及人兽共患可能性评价

发布时间：2016-11-28 07:38

1  引言 

1.1  毕氏肠微孢子虫
微孢子虫（Microsporidia）是一类细胞内专性寄生的真核生物，是感染人和动物比较常见的病原体[1]。在已知并被命名的 160 个属的 1300 多个虫种中，共有 8 个属中的 14 个虫种可以感染人类[2]。毕氏肠微孢子虫（Enterocytozoon  bieneusi）是引起人腹泻的一种机会性病原体，据报道大约 90%的毕氏肠微孢子虫病例都与免疫抑制相关[3]，然而毕氏肠微孢子虫也不断在免疫功能正常者、家畜、伴侣动物、野生动物及鸟中被发现。当宿主与被感染的人和动物、污染的食物和水源接触时就会感染毕氏肠微孢子虫病[1,4-6]。该病原对于免疫功能正常的群体主要能够引起自限性腹泻，而对于免疫功能不全的宿主（HIV 阳性患者）或者是免疫力低下的宿主（如幼龄或老龄人和动物）会引起脱水性腹泻，严重者可导致死亡[1,4-6]。 微孢子虫的生活史包括 4 个阶段：呈卵块发育的原形体阶段、呈孢子生殖的原形体阶段、孢子母细胞阶段和孢子阶段，这四个阶段都与宿主细胞质直接接触，孢子侵入细胞时伸出极管穿入宿主细胞，将孢子质通过中空的极管注入宿主细胞胞质内。孢子质在靠近宿主细胞核的空泡内通过裂体增殖和孢子增殖，发育为孢子。孢子从破裂的宿主细胞中释放并随粪便排出体外，被其他宿主摄入。 最初，人们主要通过电子显微镜观察微孢子虫的孢子或其内生发育阶段的形态特征进行鉴定[7]。随着分子生物学工具的介入，将分子生物学分型技术与流行病学研究进行结合，用于鉴定人和动物中微孢子虫的虫种和基因型，从而了解微孢子虫的传播方式。 毕氏肠微孢子虫包括多个基因型并具有广泛的宿主范围。由于不同分离株在核糖体内部转录间隔区(ITS )的序列差异较大，因此基于该位点的序列分析已广泛应用于人和动物毕氏肠微孢子虫基因分型研究中。通过比较不同宿主毕氏肠微孢子虫的 ITS 基因序列，发现不同的毕氏肠微孢子虫基因型之间，其生物学特性也有差异。例如，有些毕氏肠微孢子虫基因型只能感染人和特定的动物宿主，它们被认为具有宿主特异性[3,8]；而部分基因型则能同时感染人和动物，具有人兽共患可能性。
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1.2  贾第虫
贾第虫（Giardia）是人中最常见的肠道寄生虫，据报道在亚洲，非洲和拉丁美洲大约有2 亿人感染贾第虫并表现出一定的临床症状。人一旦感染了贾第虫病，就会引起腹泻、腹痛、腹胀、体重减轻、吸收不良等主要症状。除了感染人外，贾第虫也可感染家养动物（包括牛、羊、犬、猫）和野生动物，并能引起幼龄和老龄动物产生剧烈腹泻等症状，严重者可导致死亡。因此，贾第虫病（giardiasis）被认为是重要的人兽共患寄生虫病。贾第虫生活史简单。感染性包囊是该寄生虫的感染性阶段，随粪便排出体外并含有有丝分裂滋养体，在寒冷、潮湿的环境下仍可生存数月并具感染性。当宿主摄入含有感染性包囊的粪便时，在十二指肠内脱囊释放出滋养体。滋养体经过多次有丝分裂形成能够抵御胆汁酸和其它环境刺激的耐性包囊，并通过小肠随粪便排出体外，通过污染水源和食物或与宿主直接接触而传播贾第虫病。 
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2  材料与方法 

2.1  材料 
本研究于 2013 年 9 月至 2014 年 7 月，对黑龙江省哈尔滨市、大庆市和齐齐哈尔市三个地区的郊区农户饲养的不同年龄段的羊群进行了调查，共采集粪便样本 489 份，其中哈尔滨164 份、大庆 154 份（<1  year）和齐齐哈尔 171 份（<1  year；n  =148；>1  year；n=  23）。每份样本大约收集 30g。将哈尔滨收集到的粪便样本保存到 50ml 的一次性塑料样本盒中，并标注好样本年龄和性别等信息。运输至实验室后将粪便样本浸入到 2.5%的重铬酸钾溶液中混匀，4°C 保存备用。大庆和齐齐哈尔的样本收集在一次性无菌乳胶手套中，运输到实验室后直接保存于-20°C 冰箱中用于 DNA 提取。
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2.2  方法
对于保存在重铬酸钾中的哈尔滨粪便样本在提取 DNA 之前用灭菌水洗涤两次（12  000 r/min,  5min），以除去粪便中的重铬酸钾，，而保存在-20°C 冰箱中的大庆和齐齐哈尔粪便样本可直接用于 DNA 的提取。DNA 的提取过程在粪便提取试剂盒的操作说明的基础上加以改良，增加了玻璃珠打碎和液氮反复冻融两个步骤。具体步骤如下： (1)  取 100-300 mg 粪便样本，置于 2 ml 离心管中。 (2)  加入 1 ml Buffer SW，涡旋振荡 1 min，12,000 rpm 离心 1 min，弃上清。 (3)  加入 800 μl Buffer SL 和 0.2 g 玻璃珠，涡旋震荡 10 min，加入 600 μl Buffer GL。 (4)  液氮中冷冻  5 min，99 °C 孵育  5 min，重复 5 次，最后一次 99 °C 孵育  10 min。 (5)  12,000 rpm 离心 5 min，将上清液转移至吸附柱中（可分多次转入），12,000 rpm 离心 1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 (6)  向吸附柱中加入 500 μl Buffer GW1（使用前检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm 离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 (7)  重复步骤 7。 (8)  向吸附柱中加入 500 μl Buffer GW2（使用前检查是否已加入无水乙醇），10,000 rpm 离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 (9)  12,000 rpm 离心 2 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入新的 1.5 ml 离心管中，室温放置 2 min。 (10) 向吸附柱中悬空滴加 50 μl Buffer GE，室温放置 5 min，10,000 rpm 离心 1 min，收集 DNA溶液，-20°C 保存 DNA。  
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3  结果与分析 ........ 19 
3.1  绵羊毕氏肠微孢子虫的分子鉴定及系统进化分析 ............ 19 
3.1.1  毕氏肠微孢子虫的感染率 ......... 19 
3.1.2  毕氏肠微孢子虫基因型的分布 .......... 20 
3.1.3  毕氏肠微孢子虫系统进化分析 .......... 22 
3.2  毕氏肠微孢子虫多位点序列分型研究 .... 24 
3.2.1  微卫星和小卫星位点巢式 PCR 扩增结果 ............ 24 
3.2.2  微卫星和小卫星位点序列分型 .......... 25 
3.2.3  微卫星和小卫星位点系统进化分析 ............ 26 
3.3  绵羊贾第虫的分子鉴定及分型 ....... 27 
3.3.1  贾第虫的感染率 ...... 27 
3.3.2  贾第虫基因型的分布 ........ 28 
3.4  绵羊隐孢子虫虫种/基因型的鉴定 ........... 29 
4  讨论........... 30 
4.1  毕氏肠微孢子虫的感染情况、基因型分布及多位点序列分型 ........... 30 
4.2  贾第虫的感染情况和基因型分布 ............ 31
4.3  隐孢子虫的感染情况和虫种分布 ............ 32 
5  结论........... 33

4  讨论 

4.1  毕氏肠微孢子虫的感染情况、基因型分布及多位点序列分型

黑龙江省是我国农业大省之一，养殖业发达。哈尔滨、大庆和齐齐哈尔均位于黑龙江省西南部，在这些地区，家畜一般以家庭散养式居多，因此动物粪便中含有的毕氏肠微孢子虫对公共卫生威胁很大。目前有很多毕氏肠微孢子虫流行病学研究是关于哺乳动物和鸟类，但针对绵羊的有关研究还很少见[3,17]。刁瑞南[17]首次在绥化（东北地区）两只断奶前羔羊中发现了组 2 中的基因型 BEB6（2/40，5%）。随后，Stensvold[14]等在瑞典的 72 只羔羊中检测49（68.1%）个毕氏肠微孢子虫阳性样本，经鉴定为组 2 中的基因型 BEB6、OEB1 和 OEB2；相反，在 37 只成年羊中并未发现毕氏肠微孢子虫阳性。 最近，Zhang[68]等对中国河南、辽宁和黑龙江三个省绵羊毕氏肠微孢子虫的感染情况进行了调查研究，感染率分别为 51.9%（161/310）、9.4%（6/64）和 25.0%（10/40），该研究发现各个年龄组的绵羊都可感染毕氏肠微孢子虫，在小于 3 月龄的 25 只羔羊中检测到 13 个阳性（52.0%），在 3 到 6 月龄的 86 只小羊中发现 45 个阳性（52.3%），在 6 月龄到 1 岁之间的52 只小羊中发现 20 个阳性（38.5%），在大于 1 岁的 251 只成年羊中发现 99 个阳性（39.4%）。本研究中绵羊感染毕氏肠微孢子虫的检测结果：在哈尔滨年龄分组不详的 164 只绵羊中发现11 个阳性（6.7%），在大庆小于 1 岁的 154 小羊中发现 31 个阳性（20.1%），在齐齐哈尔小于1 岁的 148 只小羊中检测到 24 个阳性（16.2%），在大于 1 岁的 23 只成年羊中发现 2 个阳性（8.7%），该研究近一步证实了各个年龄组的绵羊都可感染毕氏肠微孢子虫。根据本研究得到的数据结果显示，成年绵羊和小羊之间的感染率差异不显著，但是大庆和齐齐哈尔集中饲养绵羊的感染率明显高于哈尔滨散养绵羊的感染率。这可能是因为集中饲养的动物之间相互接触的可能性更大，更容易导致毕氏肠微孢子虫病的传播。  

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结论 

（1）本研究在黑龙江省绵羊中检测出能感染人的毕氏肠微孢子虫基因型和十二指肠贾第虫类群，表明这两种病原在人和绵羊中存在相互传播的风险。 
（2）基于毕氏肠微孢子虫 ITS 基因位点分析，首次在绵羊中鉴定出 2 个对人有致病力的基因型 CS-4 和 Ebp C，及 3 个位于人兽共患组 1 中的新基因型（NESH1–NESH3），这些基因型均具有人兽共患潜力。 
（3）本研究发现，感染绵羊贾第虫的类群为 E 和 A，其中类群 E 为感染绵羊的优势类群，类群 A 具有人兽共患潜力。 
（4）本研究鉴定出感染黑龙江省绵羊的隐孢子虫虫种为 C. xiaoi。 
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参考文献(略)

本文编号：196226