CKIP-1在巨噬细胞增多与极化过程中功能及调控机制研究

前 言

经典的观点认为巨噬细胞起源于造血干细胞（HSCs），HSCs 经过一系列的分化成为单核细胞，单核细胞随血液流动到全身各处组织，并定居到组织中，成为组织巨噬细胞（Fig.1）[2-3]。巨噬细胞集落刺激因子（Macrophage colony stimulatingfactor，M-CSF，又称作 Colony stimulating factor 1，CSF-1）在这一过程中扮演重要角色。目前的观点认为 M-CSF 是调节巨噬细胞增殖，分化，存活最为重要的细胞因子，几乎在所有的组织中，巨噬细胞的发育均在不同程度上依赖于 M-CSF 及其受体Colony stimulating factor 1 receptor（CSF1R）所介导的信号通路[5]。对 CSF1R 敲除小鼠的研究证明了其对组织巨噬细胞发育的重要性——CSF1R 敲除的小鼠几乎缺失所有的巨噬细胞 [6]。 M-CSF 敲除小鼠的表型与 CSF1R 敲除小鼠的类似，但是却并不完全相同，M-CSF敲除小鼠依然有部分组织巨噬细胞发育正常，如小胶质细胞，朗格汉斯细胞（Langerhans cells，LC）等[7-9]。这可能是因为除 M-CSF 外，CSF1R还存在另一个配体——IL-34 [10]。M-CSF 结合 CSF1R 后，造成 CSF1R 二聚化，进而使其 C 末端的 8 个络氨酸残基磷酸化[11]。CSF1R 磷酸化激活后，会募集一系列的接头分子，如：PI3K 的 p85亚基, 磷脂酶 Cγ2, Grb2 等[5, 12-13]，进而激活下游的信号通路，从而引起增殖，分化，存活等不同的生物学效应。其中 PI3K-Akt 和 Erk 信号通路的激活与巨噬细胞增殖及存活密切相关 [14-16]。
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第一章 CKIP-1 调控巨噬细胞增殖

1.1 研究背景
GSK3β 是首个被报道的 Akt 底物。GSK3β 通常处于持续性的激活状态，Akt的激活后会磷酸化 GSK3β，使其失活[17]。β-cateinin 是 TCF/LEF 转录因子家族的共激活因子，对于促进 c-Myc，CyclinD1，CyclinD2 等与细胞增殖相关的基因的表达起重要作用。在巨噬细胞中，持续性激活的 GSK3β 会使 β-cateinin 磷酸化并促进其降解，从而抑制与细胞增殖相关的的靶基因表达。Akt 的激活使得GSK3β 的活性受到抑制，从而释放了 β-cateinin，促进 TCF/LEF 的转录活性，进而促使巨噬细胞进入增殖状态[21]。相对于其激活过程，M-CSF 信号通路如何被关闭目前还不是很清楚。我们的研究显示 CKIP-1 可能是 M-CSF 信号通路的一个负调控分子。CKIP-1 可通过抑制 TRAF6 介导的 Akt 激活，从而负调控 M-CSF 信号通路，抑制巨噬细胞增殖。

1.2 材料与方法
C57 背景的 CKIP-1 敲除小鼠为本室保存[59]，饲养及实验操作按照中国人民解放军军事医学科学院规范执行。小鼠髓系祖细胞 32D 培养于 RPMI1640 (Corning) + 10%胎牛血清(Hyclone) + 5% WEHI3 条件型培养基。稳定表达CSF1R的32D细胞系培养于RPMI 1640 + 10%胎牛血清+5% WEHI3 条件型培养基或 RPMI 1640 (Corning) + 10%胎牛血清(Hyclone) + 20% L929条件型培养基。人胚肾 293T 细胞(HEK293T)培养于含 10% 胎牛血清的DMEM 培养基 (Corning) 中。小鼠单核 - 巨噬细胞系 RAW264.7 培养于RPMI1640 + 10% 胎牛血清。PI3K 抑制剂 LY294002 购自 Santa Cruz.Phos-tagTM AAL-107 购自 Wako-Chem，λ 磷酸酶购自 NEB 公司。p65，Akt，Akt T308，IKKα/β，磷酸化 IKK，IκBα 抗体购自 CST 公司，p65 Ser276，TRAF6，CKIP-1 抗体购自 Santa Cruz。GAPDH 抗体购自中杉金桥。

第二章 CKIP-1 调控巨噬细胞极化.................................42

第三章 讨 论..........................59

3.1  CKIP-1 的生理功能.................59

3.2  CKIP-1，Akt，GKS3β 之间的调控关系.....................60

第四章 总 结.............................65

4.1  本论文获得的主要结论及创新点 .....................65

4.2  展望 ....................66

第三章讨 论

3.1 CKIP-1 的生理功能
我们的研究显示 CKIP-1 敲除小鼠对 LPS 引起的内毒素休克耐受（80%以上的敲除小鼠可存活，而野生型小鼠则诱发死亡）；体外培养的 CKIP-1-/-巨噬细胞增殖明显快于野生型细胞，同时呈现向 M2 极化的趋势；M2 极化相关分子 marker表达水平显著上调、而 M1 极化相关分子 marker 表达水平显著下调。这些数据显示 CKIP-1 在体内条件下，是巨噬细胞增殖和极性调控的重要分子。与此同时我们组的另一部分工作正在尝试靶向 CKIP-1 进行骨质酥松的治疗，并取得了阶段性的成果。靶向 CKIP-1 的 siRNA 经过成骨细胞特异的核酸递送系统传递，可以有效治疗大鼠卵巢切除诱发的骨质疏松症[81]。我们的工作对于进一步揭示 CKIP-1 的生理功能，特别是在免疫系统中的功能有重要意义；并可为在靶向 CKIP-1 的药物开发时，避免可能的不良反应提供理论基础。

3.2 CKIP-1，Akt，GKS3β 之间的调控关系
存活激酶 Akt 调控包括细胞增殖，存活，代谢，分化在内的诸多生命活动[17]。Akt 有着众多的底物，如：GSK3α/β，FOXO1， TSC2，IKKα 等[17]。其中 GSK3β是首个被鉴定到的 Akt 底物[20]。在巨噬细胞中，Akt 和 GSK3β 分别被报道处于M-CSF 信号通路的下游，，M-CSF 刺激能造成 Akt 磷酸化激活[82]，也能造成GSK3β 磷酸化失活[21]，但是二者间是否存在必然联系没有报道。我们的结果显示在 M-CSF 刺激前，加入 PI3K 抑制剂 LY294002 抑制 Akt 的磷酸化激活，能有效减少 GSK3β 的磷酸化，提示 M-CSF 造成的 GSK3β 的磷酸化失活至少在一定程度上依赖 Akt 的激活。Akt 调控 GSK3β 的活性已被广泛证实，然而作为 Akt 的底物，GSK3β 是否能反过来调控 Akt 的活性，未见报道。我们的研究结果证实 GSK3β 可通过控制一个 Akt 的负调控分子——CKIP-1 的稳定性来反馈调节 Akt 的激活。CKIP-1，Akt，GKS3β 之间形成两两抑制的负反馈环路。虽然我们仅在 M-CSF 信号通路中证明了该反馈环路的存在，但是考虑到 Akt 参与信号通路的广泛性，这可能是一个普适机制。
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第四章 总 结

4.1 本论文获得的主要结论及创新点
（1） CKIP-1 是 M-CSF 信号通路的一个负调控分子。M-CSF 及其受体 CSF1R介导的信号通路在巨噬细胞的增殖，分化，存活中发挥重要功能。相对于其激活机制，该通路的失活机制研究较少。我们的研究证实 CKIP-1 可通过抑制 TRAF6 介导的 Akt 泛素化激活从而负调控 M-CSF 下游 PI3K-Akt信号通路。PI3K-Akt 通路对于巨噬细胞的增殖和存活至关重要，我们的结果表明 CKIP-1 缺失后巨噬细胞的增殖，存活能力增强，其中的机制可能是 Akt 的过度激活。（2） CKIP-1 抑制 Akt 的磷酸化依赖 TRAF6。CKIP-1 抑制 Akt 已有报道[55]，但是其具体机制仍然不清楚。CKIP-1 可通过其 PH 结构域结合质膜[106]，但是却不能竞争 Akt 对质膜的结合。然而，其 PH 结构域对于抑制 Akt 的活性又是必需的[55]。我们的结果表明 CKIP-1 可通过抑制 Akt 的泛素连接酶 TRAF6 的活性，从而抑制其泛素化，进而抑制其膜定位。

4.2 展望
巨噬细胞的极化过程与 LPS 造成的炎症之间的关系目前研究得还不是很清楚。我们的结果显示 CKIP-1 敲除小鼠对于 LPS 造成的内毒素休克耐受，CKIP-1抑制 M2 极化而促进 M1 极化。然而，我们仅在体外研究了 CKIP-1 对巨噬细胞极化的调控，CKIP-1 敲除小鼠的表型与 CKIP-1 调控巨噬细胞极化之间的关系还有待进一步明确。此外，极化还参与动脉粥样硬化，肥胖，肿瘤等多种疾病的发生发展[4]，在这些疾病模型中进一步研究 CKIP-1 的功能十分必要。
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参考文献（略）