水产品中食源性病原菌多重PCR快速检测方法的建立

发布时间：2021-07-26 12:26

　　目的建立一种同时鉴定沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌和霍乱弧菌的多重PCR快速检测技术,为水产品中食源性病原菌检测提供新思路.方法基于沙门氏菌inv A基因、单核细胞增生李斯特菌prfA、副溶血性弧菌tlh和霍乱弧菌ompW4靶基因保守序列设计特异性引物,进行单重PCR扩增和敏感性试验;优化多重PCR反应体系中退火温度,进行多重PCR特异性、敏感性和人工添加目的菌污染鱿鱼检测试验;建立多重PCR检测技术.结果建立优化后的多重PCR对4种目标菌的单一或混合基因组DNA进行特异性扩增,而非目标菌金黄色葡萄球菌、猪霍乱沙门氏菌、普通变形杆菌、小肠耶尔森菌、大肠埃希氏菌、克雷伯氏菌、粪肠球菌、蜡样芽孢杆菌、志贺氏菌、阴沟肠杆菌等其他菌株的基因组DNA均未见任何条带;沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌和霍乱弧菌的最低检出限为104cfu/mL,副溶血性弧菌最低检出限为107cfu/mL.应用多重PCR对人工添加目标菌和非目标菌的鱿鱼进行检测,其结果可信.结论本研究建立沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌和霍乱弧菌的多重PCR检测,具有快速、简便、灵敏、准确等优点,可为水产品食源性... 

【文章来源】：北华大学学报(自然科学版). 2020,21(06)

【文章页数】：5 页

【部分图文】：

单重PCR扩增和灵敏度检测结果

由图2可以看出:退火温度对多重PCR扩增效果的影响很明显，退火温度在52～58℃时均能扩增出4条清晰的目的条带;但温度在60℃时，沙门氏菌未能扩增出目的片段，其中以退火温度为54℃(泳道2)时各菌株目的基因的扩增效率稍高，且较均衡，故选择54℃为该多重PCR的最佳退火温度．优化后的多重PCR反应体系:模板DNA8μL(各个菌DNA模板各2μL),4种引物各2μL,2×Taq Master Mix 14.5μL，总体积45μL．退火温度54℃45 s．结束反应，4℃保存，30 min后通过琼脂糖凝胶紫外成像分析系统记录并保存．2.3 多重PCR特异性试验结果

优化后的PCR反应体系通过单管多重PCR检测4株目的菌特异性，每管加入4种、3种、2种和1种混合基因组DNA，均能扩增出特异性目的片段．见图3.2.4 多重PCR灵敏度试验结果

【参考文献】：
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本文编号：3303563