大西洋三文鱼和虹鳟鱼双重PCR检测方法的建立及应用
发布时间：2021-09-03 03:59
为了实现大西洋三文鱼和虹鳟鱼的物种掺假快速检测,本研究建立了一种基于双重PCR（普通和荧光）的物种鉴定方法。通过序列分析,分别基于线粒体COⅠ和Cyt b基因设计大西洋三文鱼和虹鳟鱼特异性引物,验证引物的特异性并对双重PCR反应体系进行优化,建立大西洋三文鱼和虹鳟鱼的双重PCR快速鉴定方法。利用本研究设计的引物,仅大西洋三文鱼和虹鳟鱼可以分别扩增出108 bp和207 bp的特异性条带,而其他23种非目标物种均未有扩增条带。经验证,在双重PCR反应体系中,大西洋三文鱼和虹鳟鱼引物的最佳添加量分别为0.1和0.4μmol/L,熔解温度分别约为81.5℃和85℃。利用该方法从29份市售"三文鱼"样品中检测到6份大西洋三文鱼和3份虹鳟鱼,且与DNA条形码比对结果一致。本研究建立的大西洋三文鱼和虹鳟鱼双重PCR（普通和荧光）鉴定方法具有良好的特异性和适用性,为大西洋三文鱼和虹鳟鱼物种鉴定提供了可靠的技术手段。
【文章来源】：现代食品科技. 2020,36(12)北大核心
【文章页数】：9 页
【部分图文】：
线粒体COⅠ和Cyt b基因中双重PCR引物的相对位置
一般而言，线粒体基因组和核基因组均可以作为物种鉴定的目的基因。然而，与核基因组相比，线粒体基因组具有结构简单、序列和组成比较保守、母系遗传、无重组、单拷贝等特点[20]，已经被广泛用于水产类物种鉴定，包括鲈形目[15]、鳕形目[16]等多个不同族群的鱼类品种。本研究通过大量的序列比对分析，分别基于COⅠ和Cyt b基因设计了大西洋三文鱼和虹鳟鱼物种特异性引物（表1）。引物配对和熔解温度（Tm）是多重PCR体系建立的关键[21]。特异性引物需与目标物种的碱基位点充分配对，而与非目标物种存在一定数量的碱基位点错配，以减少非特异性扩增[22]。各组引物Tm值相近则有利于多对引物在同一个反应体系下扩增对应的目标序列[23]。本研究设计的2对引物，均与目标物种序列完全配对。并且，大西洋三文鱼特异性引物Salmo F-1和Salmo R-1与虹鳟鱼分别有5个和4个错配碱基；虹鳟鱼特异性引物Omyk F-12和Omyk R-3与大西洋三文鱼均有2个错配碱基（图1）。两对引物Tm值均约为55.0℃（表1），表明两对引物在双重PCR体系中的最适退火温度相同，有助于引物仅与目标物种DNA结合，不与非目标物种DNA进行退火[24]。
2.2 双重PCR反应体系建立为建立最佳双重PCR反应体系，对引物反应体系终浓度配比进行优化。设置（I）、（II）、（III）、（IV）四组实验进行优化对比。其中（I）组大西洋三文鱼引物（10μmol/L）和虹鳟鱼引物（10μmol/L）各加0.5μL;(II）组各加0.4μL和0.6μL;(III）组各加0.3μL和0.7μL;(IV）各加0.2μL和0.8μL。在普通PCR中，（I）、（II）和（III）扩增的虹鳟鱼特异性条带均较浅，而（IV）扩增的大西洋三文鱼和虹鳟鱼特异性条带均较清晰（图3）。在荧光PCR中，由（I）、（II）和（III）中虹鳟鱼的熔解曲线可知，虹鳟鱼的扩增效率较低，而（IV）中大西洋三文鱼和虹鳟鱼的扩增效率均较高（图4）。因此本研究确定（IV）为最佳引物浓度配比。
【参考文献】：
期刊论文
[1]三文鱼水产品掺假情况调查[J]. 丁清龙,曾晓琮,周露,李娟. 食品安全质量检测学报. 2019(13)
[2]狐狸和貉子动物源性成分双重PCR鉴别[J]. 杜利强,章晶晶,张涛,齐艳玲,李顺才,李岩,周巍,张岩. 食品科学. 2017(08)
[3]鲻鱼营养成分的研究[J]. 李来好,陈培基,杨贤庆,李刘冬,吴燕燕,刁石强. 营养学报. 2001(01)
本文编号：3380358
【文章来源】：现代食品科技. 2020,36(12)北大核心
【文章页数】：9 页
【部分图文】：
线粒体COⅠ和Cyt b基因中双重PCR引物的相对位置
一般而言，线粒体基因组和核基因组均可以作为物种鉴定的目的基因。然而，与核基因组相比，线粒体基因组具有结构简单、序列和组成比较保守、母系遗传、无重组、单拷贝等特点[20]，已经被广泛用于水产类物种鉴定，包括鲈形目[15]、鳕形目[16]等多个不同族群的鱼类品种。本研究通过大量的序列比对分析，分别基于COⅠ和Cyt b基因设计了大西洋三文鱼和虹鳟鱼物种特异性引物（表1）。引物配对和熔解温度（Tm）是多重PCR体系建立的关键[21]。特异性引物需与目标物种的碱基位点充分配对，而与非目标物种存在一定数量的碱基位点错配，以减少非特异性扩增[22]。各组引物Tm值相近则有利于多对引物在同一个反应体系下扩增对应的目标序列[23]。本研究设计的2对引物，均与目标物种序列完全配对。并且，大西洋三文鱼特异性引物Salmo F-1和Salmo R-1与虹鳟鱼分别有5个和4个错配碱基；虹鳟鱼特异性引物Omyk F-12和Omyk R-3与大西洋三文鱼均有2个错配碱基（图1）。两对引物Tm值均约为55.0℃（表1），表明两对引物在双重PCR体系中的最适退火温度相同，有助于引物仅与目标物种DNA结合，不与非目标物种DNA进行退火[24]。
2.2 双重PCR反应体系建立为建立最佳双重PCR反应体系，对引物反应体系终浓度配比进行优化。设置（I）、（II）、（III）、（IV）四组实验进行优化对比。其中（I）组大西洋三文鱼引物（10μmol/L）和虹鳟鱼引物（10μmol/L）各加0.5μL;(II）组各加0.4μL和0.6μL;(III）组各加0.3μL和0.7μL;(IV）各加0.2μL和0.8μL。在普通PCR中，（I）、（II）和（III）扩增的虹鳟鱼特异性条带均较浅，而（IV）扩增的大西洋三文鱼和虹鳟鱼特异性条带均较清晰（图3）。在荧光PCR中，由（I）、（II）和（III）中虹鳟鱼的熔解曲线可知，虹鳟鱼的扩增效率较低，而（IV）中大西洋三文鱼和虹鳟鱼的扩增效率均较高（图4）。因此本研究确定（IV）为最佳引物浓度配比。
【参考文献】：
期刊论文
[1]三文鱼水产品掺假情况调查[J]. 丁清龙,曾晓琮,周露,李娟. 食品安全质量检测学报. 2019(13)
[2]狐狸和貉子动物源性成分双重PCR鉴别[J]. 杜利强,章晶晶,张涛,齐艳玲,李顺才,李岩,周巍,张岩. 食品科学. 2017(08)
[3]鲻鱼营养成分的研究[J]. 李来好,陈培基,杨贤庆,李刘冬,吴燕燕,刁石强. 营养学报. 2001(01)
本文编号：3380358
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