白酒酿造窖泥未培养微生物菌群的可培养化策略
发布时间：2021-10-05 06:56
窖泥是厌氧微生物的重要栖息地,厌氧微生物菌群的代谢活动对浓香型白酒的香气和风味形成起着重要作用。但大多数窖泥厌氧微生物尚未能在人工实验室培养条件下培养,这严重阻碍了对窖泥厌氧菌群功能的解析。采用CGM、NBM和MCI三种营养成分丰富度不同的培养基,以典型窖泥作为菌群接种源,探索富集菌群的种类与动力学变化。扩增子测序分析表明,寡营养的MCI培养基对于富集窖泥主体菌群是较为有效的,可以同时富集得到产甲烷菌群和细菌菌群,主要包括古菌的广古菌门（Euyarchaeota）、细菌的拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）。使用基于MCI培养基的寡营养技术能有效富集窖泥中高丰度和低丰度厌氧菌,如普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、理研菌科（Rikenellaceae）、Dysgonomonadaceae、太阳杆菌科（Heliobacteriaceae）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）和甲烷八叠球菌科（Methanosarcinaceae）等;同时对扩增子测序无法检测的稀有微生物,包括甲烷鬃菌科（Methanosaetaceae）、消化链球菌科（...
【文章来源】：食品与发酵工业. 2020,46(19)北大核心CSCD
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
不同培养基富集条件下科水平群落结构组成
对于生物学重复1，窖泥中相对丰度为1%及以上的科为16个，包括普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、Dysgonomonadaceae、Cloacimonadaceae、Family＿XI＿o＿＿Clostridiales、Family＿XIV、太阳杆菌科(Heliobacteriaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、互营单胞菌科(Syntrophomonadaceae)、Gracilibacteraceae、unclassified＿c＿＿Clostridia、Synergistaceae、Acholeplasmataceae、unclassified＿Bacteria、甲烷八叠球菌科(Methanosarcinaceae)和甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)。除甲烷杆菌科、Cloacimonadaceae、Family＿XIV和互营单胞菌科4个科外，其他科均被成功富集出来，富集有效性为75%(12/16)。窖泥中相对丰度<1%的6个科，包括Clostridiaceae＿1、消化球菌科、Methanomethylophilaceae、Lachnospiraceae、norank＿p＿＿Armatimonadetes和氨基球菌科(Acidaminococcaceae)，也被成功富集。此外，还有5个科包括芽孢杆菌科(Bacillaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、甲烷鬃菌科(Methanosaetaceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、Oligosphaeraceae，在窖泥中的丰度低于扩增子测序检测限，在窖泥中甚至无法检出，但仍可被富集出来，其中Oligosphaeraceae在富集中相对期样品中丰度甚至达到10.57%。对于生物学重复2，窖泥中相对丰度为1%及以上的科为8个，包括Dysgonomonadaceae、norank＿o＿＿DTU014、动性球菌科(Planococcaceae)、互营单胞菌科(Syntrophomonadaceae)、Thermoanaerobacteraceae、太阳杆菌科(Heliobacteriaceae)、甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)和甲烷微菌科(Methanomicrobiaceae)。其中，Dysgonomonadaceae、互营单胞菌科和太阳杆菌科被成功富集，富集有效性为37.5%(3/8)。而窖泥中相对丰度<1%的13个科，包括理研菌科(Rikenellaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、Clostridiaceae＿1、Clostridiales＿Incertae＿Sedis、Family＿XIII、Gracilibacteraceae、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、消化球菌科(Peptococcaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、SRB2、Family＿XI＿o＿＿Clostridiales、甲烷八叠球菌科(Methanosarcinaceae)和Methanomassiliicoccaceae，均被成功富集。此外，还有11个科为窖泥中几乎检测不到的低丰度微生物，包括Bacteroidales＿UCG-001、Cloacimonadaceae、纤维杆菌科(Fibrobacteraceae)、norank＿c＿＿BRH-c20a、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、肠球菌科(Enterococcaceae)、Oligosphaeraceae、norank＿c＿＿Berkelbacteria、norank＿o＿＿Candidatus＿Moranbacteria、unclassified＿Bacteria和Pedosphaeraceae，也被成功富集，其中norank＿o＿＿Candidatus＿Moranbacteria在富集中期最高相对丰度达到15.06%。
通过宏基因组测序技术对典型富集样品(生物学重复1)进行进一步的菌群结构分析。如图3所示，在域水平，相对丰度>1%的类群中，73.06%属于细菌，26.67%属于古菌。而扩增子分析显示，富集样品中古菌菌群比例仅为8.68%，这表明使用针对16S rRNA基因V4可变区的515Fmod F/806RmodR引物进行扩增子分析可能低估了古菌的丰度。在门水平，扩增子测序可将菌群归属到拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、广古菌门(Euyarchaeota)、黏胶球形菌门(Lentisphaerae)、变形菌门(Proteobacteria)、互养菌门(Synergistetes)和未分类门unclassified＿Bacteria，而宏基因组测序技术并未检测到黏胶球形菌门(Lentisphaerae)。在科水平，宏基因组学分析结果显示所得序列仅可归属到11个科，少于扩增子测序的分析结果(17个科)。其中，在宏基因组测序结果中，甲烷鬃菌科(Methanosaetaceae,20.09%)和紫单胞菌科(Porphyromonadaceae,17.53%)为主要的主导菌群;扩增子分析结果显示，富集样品中的主导菌群为Dysgonomonadaceae(25.15%)和理研菌科(Rikenellaceae,13.53%)，而主导甲烷菌甲烷鬃菌科(Methanosaetaceae)最高相对丰度仅可达到6.76%，远低于宏基因组学分析结果，再次表明扩增子测序低估了古菌菌群的丰度。此外，值得注意的是，随着分类水平的提高，宏基因组和扩增子测序的未分类序列(others)的比例都越来越高，其中在科水平，宏基因组测序的未分类序列比例高达34.33%，这是由于窖泥中的大部分细菌和古菌尚未在全基因组水平得到鉴定，目前的宏基因组学数据库对于窖泥微生物基因组结构的解析度非常有限。用宏基因组数据对富集菌群物种信息进行注释，如表1所示。
【参考文献】：
期刊论文
[1]泸型酒窖泥中梭菌的分离及代谢产物分析[J]. 蒲秀鑫,柴丽娟,徐鹏翔,张晓娟,陆震鸣,王松涛,沈才洪,史劲松,许正宏. 微生物学报. 2019(12)
[2]白酒窖泥微生物多样性研究方法及进展[J]. 郭壮,赵慧君,雷敏,沈馨,蔡宏宇,张振东. 食品研究与开发. 2018(22)
[3]未培养微生物分离培养技术研究进展[J]. 邢磊,赵圣国,郑楠,李松励,王加启. 微生物学通报. 2017(12)
[4]从环境中分离培养微生物:培养基营养水平至关重要[J]. 周楠,姜成英,刘双江. 微生物学通报. 2016(05)
[5]浓香型白酒窖池主要功能性微生物的研究进展[J]. 侯小歌,王俊英,李学思,胡炳义,李绍亮,高应运. 酿酒科技. 2013(02)
[6]难培养微生物培养方法的研究进展[J]. 曾建民,曾振顺,原红娟,谭志远. 生物技术进展. 2012(03)
[7]泸型梭菌己酸发酵应用的理论与实践[J]. 吴衍庸. 酿酒科技. 2007(11)
[8]自然界中难分离培养微生物的分离和应用[J]. 岳秀娟,余利岩,李秋萍,魏玉珍,关艳,张月琴. 微生物学通报. 2006(03)
博士论文
[1]泸州老窖不同窖龄窖泥中细菌及古菌种群多样性和系统发育研究[D]. 熊亚.四川农业大学 2014
[2]海洋微生物高通量培养和分选技术的建立及应用[D]. 冀世奇.中国海洋大学 2011
本文编号：3419226
【文章来源】：食品与发酵工业. 2020,46(19)北大核心CSCD
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
不同培养基富集条件下科水平群落结构组成
对于生物学重复1，窖泥中相对丰度为1%及以上的科为16个，包括普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、Dysgonomonadaceae、Cloacimonadaceae、Family＿XI＿o＿＿Clostridiales、Family＿XIV、太阳杆菌科(Heliobacteriaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、互营单胞菌科(Syntrophomonadaceae)、Gracilibacteraceae、unclassified＿c＿＿Clostridia、Synergistaceae、Acholeplasmataceae、unclassified＿Bacteria、甲烷八叠球菌科(Methanosarcinaceae)和甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)。除甲烷杆菌科、Cloacimonadaceae、Family＿XIV和互营单胞菌科4个科外，其他科均被成功富集出来，富集有效性为75%(12/16)。窖泥中相对丰度<1%的6个科，包括Clostridiaceae＿1、消化球菌科、Methanomethylophilaceae、Lachnospiraceae、norank＿p＿＿Armatimonadetes和氨基球菌科(Acidaminococcaceae)，也被成功富集。此外，还有5个科包括芽孢杆菌科(Bacillaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、甲烷鬃菌科(Methanosaetaceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、Oligosphaeraceae，在窖泥中的丰度低于扩增子测序检测限，在窖泥中甚至无法检出，但仍可被富集出来，其中Oligosphaeraceae在富集中相对期样品中丰度甚至达到10.57%。对于生物学重复2，窖泥中相对丰度为1%及以上的科为8个，包括Dysgonomonadaceae、norank＿o＿＿DTU014、动性球菌科(Planococcaceae)、互营单胞菌科(Syntrophomonadaceae)、Thermoanaerobacteraceae、太阳杆菌科(Heliobacteriaceae)、甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)和甲烷微菌科(Methanomicrobiaceae)。其中，Dysgonomonadaceae、互营单胞菌科和太阳杆菌科被成功富集，富集有效性为37.5%(3/8)。而窖泥中相对丰度<1%的13个科，包括理研菌科(Rikenellaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、Clostridiaceae＿1、Clostridiales＿Incertae＿Sedis、Family＿XIII、Gracilibacteraceae、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、消化球菌科(Peptococcaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、SRB2、Family＿XI＿o＿＿Clostridiales、甲烷八叠球菌科(Methanosarcinaceae)和Methanomassiliicoccaceae，均被成功富集。此外，还有11个科为窖泥中几乎检测不到的低丰度微生物，包括Bacteroidales＿UCG-001、Cloacimonadaceae、纤维杆菌科(Fibrobacteraceae)、norank＿c＿＿BRH-c20a、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、肠球菌科(Enterococcaceae)、Oligosphaeraceae、norank＿c＿＿Berkelbacteria、norank＿o＿＿Candidatus＿Moranbacteria、unclassified＿Bacteria和Pedosphaeraceae，也被成功富集，其中norank＿o＿＿Candidatus＿Moranbacteria在富集中期最高相对丰度达到15.06%。
通过宏基因组测序技术对典型富集样品(生物学重复1)进行进一步的菌群结构分析。如图3所示，在域水平，相对丰度>1%的类群中，73.06%属于细菌，26.67%属于古菌。而扩增子分析显示，富集样品中古菌菌群比例仅为8.68%，这表明使用针对16S rRNA基因V4可变区的515Fmod F/806RmodR引物进行扩增子分析可能低估了古菌的丰度。在门水平，扩增子测序可将菌群归属到拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、广古菌门(Euyarchaeota)、黏胶球形菌门(Lentisphaerae)、变形菌门(Proteobacteria)、互养菌门(Synergistetes)和未分类门unclassified＿Bacteria，而宏基因组测序技术并未检测到黏胶球形菌门(Lentisphaerae)。在科水平，宏基因组学分析结果显示所得序列仅可归属到11个科，少于扩增子测序的分析结果(17个科)。其中，在宏基因组测序结果中，甲烷鬃菌科(Methanosaetaceae,20.09%)和紫单胞菌科(Porphyromonadaceae,17.53%)为主要的主导菌群;扩增子分析结果显示，富集样品中的主导菌群为Dysgonomonadaceae(25.15%)和理研菌科(Rikenellaceae,13.53%)，而主导甲烷菌甲烷鬃菌科(Methanosaetaceae)最高相对丰度仅可达到6.76%，远低于宏基因组学分析结果，再次表明扩增子测序低估了古菌菌群的丰度。此外，值得注意的是，随着分类水平的提高，宏基因组和扩增子测序的未分类序列(others)的比例都越来越高，其中在科水平，宏基因组测序的未分类序列比例高达34.33%，这是由于窖泥中的大部分细菌和古菌尚未在全基因组水平得到鉴定，目前的宏基因组学数据库对于窖泥微生物基因组结构的解析度非常有限。用宏基因组数据对富集菌群物种信息进行注释，如表1所示。
【参考文献】：
期刊论文
[1]泸型酒窖泥中梭菌的分离及代谢产物分析[J]. 蒲秀鑫,柴丽娟,徐鹏翔,张晓娟,陆震鸣,王松涛,沈才洪,史劲松,许正宏. 微生物学报. 2019(12)
[2]白酒窖泥微生物多样性研究方法及进展[J]. 郭壮,赵慧君,雷敏,沈馨,蔡宏宇,张振东. 食品研究与开发. 2018(22)
[3]未培养微生物分离培养技术研究进展[J]. 邢磊,赵圣国,郑楠,李松励,王加启. 微生物学通报. 2017(12)
[4]从环境中分离培养微生物:培养基营养水平至关重要[J]. 周楠,姜成英,刘双江. 微生物学通报. 2016(05)
[5]浓香型白酒窖池主要功能性微生物的研究进展[J]. 侯小歌,王俊英,李学思,胡炳义,李绍亮,高应运. 酿酒科技. 2013(02)
[6]难培养微生物培养方法的研究进展[J]. 曾建民,曾振顺,原红娟,谭志远. 生物技术进展. 2012(03)
[7]泸型梭菌己酸发酵应用的理论与实践[J]. 吴衍庸. 酿酒科技. 2007(11)
[8]自然界中难分离培养微生物的分离和应用[J]. 岳秀娟,余利岩,李秋萍,魏玉珍,关艳,张月琴. 微生物学通报. 2006(03)
博士论文
[1]泸州老窖不同窖龄窖泥中细菌及古菌种群多样性和系统发育研究[D]. 熊亚.四川农业大学 2014
[2]海洋微生物高通量培养和分选技术的建立及应用[D]. 冀世奇.中国海洋大学 2011
本文编号：3419226
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