“鲁红1号”元宝枫的叶色表现及其MYB转录因子的基因克隆

发布时间：2016-04-19 23:30

1引言

近年来，很多企事业单位从欧美及日本等国家大量引进彩色叶植物新品种，其中有的品种表现优良；很多品种适应性较差，对我国园林建设具有潜在不良影响。其实，我国彩叶树种资源十分丰富，很多彩叶树种资源尚未深入研究与开发应用，元宝枫就是其中值得深入研究的一个树种。元宝枫（Acer truncatum Bunge），为槭树科（Aceraceae）槭树属的落叶乔木，其种内叶色、叶形变异广泛，但是，在华北、华东的城市园林中，多数元宝枫植株的叶色表现一般，而‘鲁红 1 号’是课题组经多年研究选育出的元宝枫的一个品系，其秋叶鲜红，红叶持续的时间很长，观赏价值高，更适合作庭荫树、行道树或风景林树种。目前，我国对彩色叶植物的研究处于初级阶段。对它的研究主要集中在栽培和开发利用方面，分子生物学方面的研究很少，没有完整的分子层面上的研究体系，严重阻碍了彩叶植物在叶色方面分子育种的研究进程。‘鲁红 1 号’为开展元宝枫分子生物学研究提供了优良试材，通过对其叶片色彩表达的分子机理研究，为槭属彩叶品种的分子育种、为彩色叶植物的人工调控叶色、定向培育彩色叶植物奠定基础。

1.1植物花色苷的研究进展
花色苷广泛存在于植物中，是决定植物花、果实和叶片等的颜色的重要色素之一。花色苷是苯丙氨酸代谢途径的产物，它是一类水溶性色素，在细胞质及内质网膜中合成，运输到液泡后，呈现出红色、黄色、蓝色和紫色等丰富的色彩（Gillian，2001；Martin et al.，1993）。花青素苷可诱导根瘤菌，，抑制病虫害，吸引昆虫传粉，使果实免受紫外光伤害等，花色素苷又有抗氧化、抗动脉硬化、延缓衰老的作用（Kramer et al.，2004；Nakaishi et al.，2000；Tsuda et al.， 2003），人体保健功能也备受人们注视。
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1.2叶色基因工程及展望
花色苷生物合成的结构基因和转录因子的深入研究，为类黄酮代谢途径的各支路工程开展奠定了扎实的基础，且取得了瞩目的成绩，尤其是将基因工程技术应用于观赏植物花色的分子育种（即花色基因工程）更是取得了巨大的成功，相对于成功进入市场的转基因花卉来说将基因工程技术应用于彩叶植物叶色的分子育种还处于起步阶段，并且相对于花瓣来说叶片的呈色机理和调控机理更复杂得多，这就更不利于叶色基因工程的进展。目前为止，仍未见应用。至今，国内外对具有较高经济价值及广泛园林用途的彩色叶植物的叶色呈色机理研究报道较少。因此，从分子方面研究彩色叶植物叶色的呈色机理具有重要的理论意义及实际价值。进而在叶片呈色的分子机理研究的基础上，借鉴类黄酮和花色基因工程的一些策略，可以有目的开展叶色基因工程。具体的可以从这些方面入手：研究影响叶色呈色的生理生化机制，从分子生物学的角度研究彩叶变色过程中的结构基因的表达变化，进行叶色的基因转录调控因子及定向分子育种的研究，使常绿树种形成彩叶，并繁殖和培育出更多丰富多彩的彩色叶植物。这将是今后彩色叶植物重要的研究内容，也将是彩色叶植物广泛应用于城市园林绿化的基础。
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2材料与方法

2.1材料
2.1.1植物材料
本试验的供试材料包括‘鲁红1号’原株及其自由授粉子代家系，以普通元宝枫为对照。‘鲁红1号’为课题组选育的秋叶鲜红的元宝枫新品系，位于山东农业大学试验基地；其家系对比试验林设在济南百合园林集团的苗圃中，实验林始建于2010年春，现已经达5年，长势良好。

2.1.2 菌株及载体
本实验研究用的大肠杆菌DH5a菌株和基因克隆载体pMD18-T Vector均购自于大连宝生物生物工程有限公司。

2.1.3试剂盒、生化试剂
TRIZOL试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；EASY spin Plus 植物RNA快速提取试剂盒购自于北京艾德莱生物科技有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒（DP209-02）北京天根生化科技有限公司；MightyAmp? DNA Polymerase Ver.2 试剂盒、EasyTaqTM First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒均购自北京全式金生物技术 有 限 公 司 ； 5′ RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends,Version 2.0（18374-058）试剂盒购自Invitrogen公司；SMARTer? RACE cDNA Amplification Kit（634923）试剂盒购自Clontech 公司。实验研究过程中所用的试剂DEPC 、CTAB、EDTA-Na2?2H2O、Tris、PVP、β-巯基乙醇、SDS、EB、Amp、IPTG、X-gal、琼脂糖、琼脂粉、酵母粉、胰蛋白胨等纯试剂均购于大连宝生物工程有限公司；DL2000 分子 Marker购自北京全式金生物技术有限公司；CaCl2、甲醇、LiCl、NaCl、NaAc、NaOH、冰乙酸、浓盐酸、氯仿、异戊醇、无水乙醇等试剂均购自北京索莱宝生物工程有限公司；部分水是用超纯水。
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2.2方法
参照王慧聪等（王慧聪等，2004）的方法，以株为实验单元，每个时间段每株树分别采集叶片，采集后，立即用冰盒带回实验室。将叶片切碎混匀，取 0.5 克叶片于离心管，加10ml1%Hcl/甲醇溶液，放于 4℃冰箱中浸提 2h。用分光光度计测各提取液在553nm 和 600nm 处的吸光值。以每克叶片质量的提取液的光密度变化值D553nm-D600nm=0.01 作花色苷单位，用 U 表示。核酸蛋白分析仪检测：取1μl RNA样品，用ND-2000核酸蛋白分析仪进行含量以及纯度的测定。电泳检测：（1）称0.2g琼脂糖于容器中，加入20ml电泳缓冲液，加热溶解，冷却到60℃时加入0.5μl的EB染色。（2）将凝胶液倒入槽中，约凝固半个小时。（3）待胶凝好之后拔出梳子，将胶放入电泳槽中，点样（5ul RNA+1μl 6×Loading Buffer）（4）在和l×TAE缓冲液下，10 V/cm 稳压条件下电泳15 min，对RNA纯度和完整性进行电泳检测。
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3 结果与分析.....26
3.1‘鲁红 1号’叶片花色苷含量及叶色......26
3.2‘鲁红 1号’自由授粉子代的叶色表现.........27
3.3‘鲁红 1号’ MYB 转录因子基因的克隆......31
3.3.1‘鲁红 1号’叶片总 RNA 的质量与产率....31
3.3.2 ‘鲁红 1号’ MYB 转录因子基因的分离.........32
3.3.2.1 MYB转录因子基因 cDNA 的全长..... 33
3.3.2.2 核酸序列分析......34
3.3.2.3 MYB转录因子基因编码蛋白的二级结构预测........36
3.3.2.4氨基酸序列的进化树分析.......36
4 讨论..........38
4.1‘鲁红 1号’叶片花色苷含量及叶色......38
4.2‘鲁红 1号’叶色性状的遗传模式..........38
4.3‘鲁红 1号’叶片总 RNA 提取.........39
4.4 ‘鲁红 1号’MYB 转录因子基因....40
5 结论与创新点........42
5.1结论.......42
5.2创新点..........42

4讨论

4.1‘鲁红 1号’叶片花色苷含量及叶色

花色苷广泛存在于植物体内，是决定植物的叶、花、果实等颜色的重要因素之一。花色苷的生物合成除了受调控基因和结构基因的协同调节之外，还受到内在激素和外在环境的影响，同时外在环境影响因素主要包括光照和温度。各种树在秋末的时候花色苷含量均在不同程度上逐渐升高,这是因为温度不仅在基因转录水平上影响花色苷的生物合成，也对花色苷的稳定有影响，而低温会诱导与花色苷合成相关的基因表达，从而使花色苷含量升高。在彩色叶植物的叶片渐渐趋于衰老过程中,花色苷含量升高能够起到保护叶片细胞和光合结构的作用。叶片的色泽在花色苷种类一定的条件下，主要受到花色苷的含量的影响。叶片中花色苷含量与叶片的转色过程有密切关系，且不同的种、品种之间存在着一定差异。本试验结果显示：花色苷的积累与叶片的发育过程密切相关：伴随着叶片的发育‘鲁红1号’叶片中的花色苷的含量在转色盛期达到高峰，之后伴随着叶片的衰老花色苷的含量逐渐降低，同时叶片的颜色由最初的淡红色到深红色最后变为暗红色（如附图说明中的图1、2、3、4）。其它两种对照元宝枫的叶片花色苷含量变化趋势与‘鲁红1号’的无异，‘鲁L-2’植株叶片中花色苷含量只是在原来的基础上有着轻微的变动，‘鲁红1号’叶片中花色苷的含量远远高出于其它两种对照元宝风的含量。显示在叶色上就表现为‘鲁红1号’秋季叶片的叶色比‘鲁C-1’和‘鲁L-2’的要红的多（如附图说明中的图1、2、3、4、5、6）。由此我们推测，‘鲁红1号’叶片的呈色差异在于花色苷积累的多少。

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结论

本研究主要以‘鲁红1号’及其自由授粉子代家系为研究材料，测定了花色苷含量及从连续5年的秋季叶片叶色参数，提取秋季叶片总 RNA，并通过 PCR成功的克隆了MYB转录因子基因。本研究的主要结论如下：
1. ‘鲁红1号’叶片花色苷的含量在转色期呈先上升后下降的趋势，且是对照的两倍还要多，且其叶片花色苷的含量与叶色参数a呈正相关。
2.‘鲁红1号’自由授粉子代在秋季转色期有90%左右的个体叶色呈红色或偏红，年度间较稳定，具有显性特征，推测属于核基因控制。
3.建立了改良 CTAB 法提取‘鲁红1号’叶片总 RNA，提取的总 RNA 纯度高、浓度大，达到 RT-PCR 及建立文库的要求，同时该方法也为其它多糖多酚植物的总 RNA提取提供借鉴。
4. 克隆了MYB转录因子基因，经氨基酸比对、进化树分析、生物信息分析结果都证实了MYB属 R2R3MYB 类转录因子，推测具有调控‘鲁红1号’花色苷生物合成的功能。该MYB转录因子基因被命名为LH-MYB。
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参考文献(略)

本文编号：38865