百子莲胚性愈伤组织超低温保存中钙离子的分布变化及逆境应答机制初探

第一章 文献综述

1.1 百子莲属植物种质资源研究概况
百子莲（Agapanthus praecox）又名“蓝百合”、“非洲百合”，原产自非洲南部，为单子叶常绿或多年生草本花卉。百子莲属植物具有很强的观赏性，叶片基生，披针形，深绿色带有光泽，长度可达 60 cm 左右。花序为聚伞花序，每个花序上着生小花 50~130 朵，花漏斗形，花茎直立，可以生长至 1 m 长，花期在夏秋两季长达 30~40 天，百子莲栽培种的花期在上海集中在 6~8 月[1]。百子莲科只有百子莲属一个属，其中常绿种 2 个百子莲（A africanus）和旱花百子莲（A praecox），落叶种 4 个铃花百子莲（A campanulatus）、具茎百子莲（A caulescens）、寇蒂百子莲（A coddii）和德拉肯斯堡百子莲（A inapertus）。近半个世纪以来，百子莲在国际花卉业发展中脱颖而出，成为西方发达国家的高档主流花卉，风靡全球的观赏花卉，从道路绿化、庭院栽培到切花生产，都体现出了百子莲属植物较高的观赏价值[2]。百子莲在国外是较为流行的花卉品种，有关百子莲的研究较多而且应用较广泛，研究多集中在分类学、药效及成份分析、分子育种及园林应用等方面，应点出几个代表性成果。百子莲属植物自 2000 年引种到国内以来，对其的研究主要集中在栽培和生理方面。对百子莲的生理生态习性、开花生物学特性、种子生物学和幼苗生长特性、快速繁殖体系、组培再生体系及其在园林中的应用等方面均有研究。
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1.2 植物超低温保存相关研究进展
植物超低温保存(Crypreservation)是指在低于-80°C 的温度条件下（通常为液氮温-196°C ），对植物器官、组织或者细胞进行保存[18]。在低温条件下，植物材料细胞内的物质代谢和生长活动几乎停止，保存的植物材料处于相对稳定的生物学状态。超低温降保存可降低甚至完全抑制植物材料的生活力及基因变异的可能性，保持植物材料遗传性状的稳定和形态发生的潜能[19]。植物超低温保存技术应用的理论可分为两类，一类依据冷冻脱水原理，该理论是超低温保存发展起来的基本即植物细胞在有冰冻保护剂存在的降温过程中，当细胞外的介质结冰而细胞内尚未结冰，产生的细胞内外的蒸汽压差，只要降温速率不超过脱水的连续性，细胞内的水分会不断向细胞外扩散，细胞原生质浓缩，从而降低细胞内含物的冰点，能有效地避免细胞质或液泡中冰晶的形成，这种逐渐脱去细胞内水分的过程称为“保护性脱水”；另一类依据溶液玻璃化原理，细胞内晶核形成、晶核生长是细胞结冰必经的两个过程，若溶液降温速度足够快，溶液内很少或者几乎没有形成均一的晶核，或溶液内的晶核生长缺乏足够的时间，溶液就会进人玻璃态，玻璃态是一种透明的固态，此时的温度称为玻璃化转变温度。植物材料经高浓度的渗透性化合物处理后，迅速投入液氮中较易进入玻璃态，玻璃态在液氮保存中是稳定的，对细胞组织结构影响很小，保证了植物材料复苏后的细胞活力[20]。
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第二章 超低温保存过程中百子莲胚性愈伤组织细胞超微结构观察

2.1 材料与方法
本试验所用百子莲胚性愈伤组织（embryogenic callus，EC）由上海交通大学农业与生物学院园林植物种质工程试验室提供。百子莲 EC 在含 10 mg/L 毒莠定（PIC）、30 g/L 蔗糖和 10 g/L 琼脂粉的 MS 培养基上每隔 30 d 继代一次，取继代培养 20 d 后的 EC 作为对照和后续试验的材料。对百子莲 EC 超低温保存过程中预培养、脱水处理、恢复培养及对照处理的细胞超微结构进行观察和比较。超低温保存各关键步骤如下，预培养：将继代培养 20 d 的百子莲 EC（对照样品 CK）放在 05 mol/L 蔗糖的 MS 固体培养基上低温（4°C ）预培养 2 d。装载：将预培养后的 EC 置于装载液（2 mol/L 丙三醇+04 mol/L 蔗糖+ 10 mmol/LKNO3+MS 液体培养基）中在室温下处理 60 min。脱水：将装载处理后的百子莲的 EC移入 PVS2 玻璃化溶液（30%丙三醇+15% DMSO+15%乙二醇+04 mol/L 蔗糖+MS液体培养基）中在 0°C 下脱水处理 40 min，脱水后立即将装有 EC 的 PVS2 冷冻管浸入液氮中冻存。洗涤：液氮冻存 1 h 后，将冻存管置于 40°C 水浴中快速解冻 90 s，再转到室温下用去装载液（12 mol/L 蔗糖+ 10 mmol/L KNO3 +MS 液体培养基）洗涤 3 次，每次间隔 10 min。恢复培养：超低温保存后的百子莲 EC 置于新的继代培养基上培养 24 h。
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2.2 结果与分析
电镜观察结果见图 2-1 所示：百子莲 EC 细胞显示出清晰的细胞结构，细胞含有多个大小不一的液泡，一个大液泡占据了细胞的大部分空间，小体积液泡较少（图 2-1 a1）。细胞的质膜结构清晰完整，细胞膜紧贴细胞壁。细胞内各细胞器完好，线粒体、高尔基体、内质网呈现出正常的细胞器结构，其中线粒体的数量最多，线粒体的膜结构和内脊清晰可见（图 2-1 a2-a4）。细胞中可见包含淀粉粒的淀粉体和脂质体（图 2-1 a3-a4）。以上观察说明这是一个细胞结构完整、代谢正常的百子莲 EC 细胞。高渗培养基对百子莲 EC 进行预培养，可以诱导细胞脱出部分自由水，提高细胞的抗冻能力。在 05 mol/L 蔗糖的 MS 固体培养基上，4°C 条件下预培养 2 d后，百子莲 EC 细胞超微结构出现了一些变化，观察结果见图 2-2 所示：细胞发生了质壁分离，但细胞膜质结构完整，大部分细胞质壁分离程度轻微，小部分质壁分离严重的细胞，在细胞壁与细胞质之间产生了较大明显的空腔（图 2-2 b1-b2）。细胞内大液泡变小，小液泡增多。与对照相比较细胞中细胞器不同程度的皱缩，高尔基体和内质网结构变化明显，线粒体为数量最多的细胞器，与对照处理相比，线粒体数量增多，多数线粒体紧贴细胞膜内侧排列分布（图 2-2 b2）。线粒体、高尔基体和内质网等细胞器发生了不同程度的皱缩现象，细胞内大淀粉粒变小，小淀粉粒增多（图 2-2 b3-b4）。

第三章 超低温保存过程中百子莲EC脂肪酸的组成和变化.........23
3.1  材料与方法........23
3.2 结果与分析........24
3.2.1 百子莲 EC 饱和脂肪酸的组成及变化........24
3.2.2 百子莲 EC 不饱和脂肪酸的组成及变化........25
3.3 讨论........27
第四章 百子莲 EC超低温保存过程中钙离子的分布变化........29
4.2  结果与分析........30
4.2.1 百子莲 EC 继代培养（对照）细胞 Ca2+亚细胞定位观察........30
4.2.2 超低温保存过程中细胞Ca2+亚细 胞定位观察........31
4.2.3 焦锑酸钙沉淀颗粒组分的能谱分析........35
4.2.4 百子莲 EC 超低温保存过程中Ca2+荧光 变化测定........36
4.2.5 超低温保存过程中百子莲EC细胞内 Ca2+荧光强度变化........38
4.3 讨论........ 38
第五章 百子莲 EC 超低温保存过程中比较转录组学分析........41
5.1  材料与方法........ 41
5.2  结果与分析........47

第五章 百子莲 EC 超低温保存过程中比较转录组学分析

百子莲为非模式植物，其基因组序列与转录组序列未知。目前只能依靠传统的转录组学方法（cDNA-AFLP，SSH，DDRT-PCR 等）进行转录组学分析以筛选出某个生物过程中的差异表达基因，但是传统的方法由于技术瓶颈导致其分辨率较低，大部分差异基因丢失，这对深入科学研究带来了较大的限制。目前二代高通量测序技术（NGS）的兴起，极大地推动了非模式植物的基因组与转录组学的研究，通过转录组测序技术能够快速而全面揭示某个物种的转录组序列信息，这对今后非模式物种的基因克隆、功能与结构分析、遗传转化及基因差异表达（RNA-seq）等方面的研究奠定了坚实的基础。在超低温保存过程中对百子莲 EC 的细胞结构、膜脂组成、和钙离子分布的研究基础上发现脱水处理是超低温保存中的最关键处理步骤，本研究结合RNA-seq 测序对百子莲 EC 对照处理、脱水处理及恢复培养进行比较转录组学分析，从转录组学角度综合阐述百子莲胚性愈伤组织超低温保存的逆境应答的机制，从而为进一步优化超低温保存技术体系的相关参数提供理论依据。

结论

本项试验开展了百子莲 EC 玻璃化超低温保存各关键步骤中的细胞超微结构观察、细胞膜脂组成分析、细胞 Ca2+分布及比较转录组学的研究，初步得到以下几个结论：
1.百子莲 EC 细胞能通过细胞结构的变化响应超低温保存过程中的逆境胁迫，璃化溶液脱水处理中主要经受氧化胁迫。细胞器结构的损伤及细胞膜质结构损伤导致超低温保存细胞死亡。可逆的细胞结构变化是细胞对逆境胁迫自我保护的一种适应性响应，提高自身的抗性，不可逆的结构变化将造成细胞的死亡。
2.百子莲 EC 经预培养和脱水处理后，不饱和脂肪酸含量升高可以维持细胞膜稳定性，减少逆境胁迫损伤，提高细胞对低温胁迫和氧化胁迫的抗性。
3.Ca2+是逆境胁迫信号转导过程中重要的信号分子。通过细胞内不均匀梯度分布和细胞质中的 Ca2+浓度变化响应逆境胁迫信号，从而调控生理代谢及基因表达。证实脱水处理中百子莲 EC 在逆境中主要经受氧化胁迫和低温胁迫，可在脱水处理中的玻璃化溶液中添加还原性物质优化百子莲超低温保存体系。
4.基于 RPKM 法比较分析了组织间差异表达基因，对照处理的胚性愈伤组织与脱水处理的胚性愈伤组织间差异表达基因总数为 3027。脱水处理的胚性愈伤组织与恢复培养的胚性愈伤组织间差异表达基因总数为 5737。GO 显著性富集分析结果表明差异表达基因主要富集在：外源刺激响应、胁迫响应、植物激素信号转导、转录调控、内吞作用、糖代谢、次生代谢、质膜结构及转录因子。在脱水处理中百子莲 EC 对逆境的响应表现在细胞膜质结构、还原性物质和植物激素的变化，在恢复培养中对超低温保存处理逆境响应表现在细胞结构修复及发育相关物质合成代谢。在优化百子莲超低温保存体系中适当添加植物激素和还原性物质，可能对提高百子莲超低温保存的恢复生长率有积极作用。
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参考文献（略）