苹果酒酵母 BAT2 基因和支链氨基酸代谢对香气形成的影响

发布时间：2016-05-06 05:45

第一章 文献综述

1.1 苹果酒是苹果精深加工发展的趋势
1.1.1 苹果产业的发展现状及问题

我国是世界上盛产苹果的国家，苹果品种多，产量大。根据国家统计局统计数据（如图 1-1），2003-2013 年间，我国的苹果产量和苹果种植面积均呈持续增长态势，2013 年产量已达 3968.26 万吨。在苹果产业快速发展带动农村经济发展和推动农民增收的同时，市场销售压力剧增。

根据国家统计局对我国 2003-2013 年间苹果汁出口量及 2006-2013 年间鲜果出口量统计（如图 1-2）可以看出，2013 年苹果鲜果出口量维持在大约 100 吨的低位水平，苹果汁出口从 2009 年的 117 万吨逐年下降到 2013 年的 53 万吨（大约合计 400 万吨左右鲜果），导致苹果汁加工行业呈现严重的生产过剩局面，加之有限的苹果鲜果出口量，其余的 3400 万吨鲜果将主要依靠国内的鲜食零售市场来消化。然而，国内苹果鲜食消费能力有限，最终导致苹果产业效益下降和卖果难的局面(阮仕立和李华 2000)。数据显示，我国苹果的种植面积和产量分别占世界面积和产量的 40%和 50%以上，但鲜苹果和苹果汁出口量占世界出口量的比重自 2007 年以来呈逐渐下降趋势，这种产量与加工、销售之间的矛盾使苹果产业成为一个“高投入、高风险、高收益”的产业(赵军华等 2014)。面对中国苹果产业发展的巨大挑战，一方面要积极开拓国际市场，扩大出口；另一方面要积极调整产业结构，尤其是要转变苹果加工业单纯依赖浓缩苹果汁加工业的局面，进一步丰富苹果加工的途径，化解国际苹果汁市场需求低迷对我国苹果产业发展带来的不利影响，鼓励企业投资发展非酒精类果汁饮料如苹果酒等加工项目，减轻苹果销售压力，并同时提高产品附加值，促进中国苹果产业健康发展。 

苹果作为一个世界性生产和消费的水果，许多发达国家多年发展苹果产业的成熟经验可供我国借鉴。苹果加工业发达的国家已经减少了苹果汁这种初级的加工方式，除了鲜食之外主要加工为苹果酒、苹果醋以及苹果白兰地（Watson 2013）。苹果酒是以纯苹果汁为原料发酵而成的饮料酒，多为微发酵酒，是果汁与酒的过度产品，既具有果汁的风味，又具有酒的芳香，既可将大量非商品苹果转化增值，又可满足人们的消费需求，符合饮料酒的未来发展方向。另外，果酒消费将逐渐成为我国酒类消费的主体，国家在宏观产业政策上也制定了“粮食酒向水果酒转变”的发展策略，这为苹果酒的发展提供了契机(王娟和徐桂花 2006)。

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1.2 苹果酒产业现存的问题
1.2.1 专用苹果酒发酵菌种缺少
酵母菌种的发酵性能是否良好直接影响苹果酒的品质。目前，国内外用于生产苹果酒的酵母多为葡萄酒酵母或从自然界分离的酵母菌，这 2 类酵母菌均不同程度地存在着酿酒风味较差、出酒率低、酒体及品质稳定性差等弊端(宋安东和吴云汉 2002)。我国苹果酒生产中所采用的酵母多为葡萄糖用酵母，这种酵母是针对葡萄及葡萄酒生产开发的，由于苹果汁与葡萄汁的成分差别很大，该酵母并不适合苹果酒酿造。以氨基酸成分为例，Spayd and Andersen-Bagge(1996)测定葡萄汁中游离的精氨酸和脯氨酸含量最高，王丽( 2007 ) 测定苹果汁中游离的丝氨酸和天冬氨酸含量最高（如图 1-3 所示）。1907年，Ehrlich 发现氨基酸是一些重要酒体香气成分的前体。因此，发酵基质中氨基酸的组成对发酵酒体的挥发性香气成分具有重要的作用。葡萄酒酿造酵母在苹果酒生产工艺中的表现并不理想，其主要原因可能就是葡萄汁中的氨基酸组成与苹果汁中的氨基酸组成不同。另外，碳水化合物组成也存在较大的差别。如表 1-2 所示，苹果与葡萄中的可发酵性糖的比率几乎相差一倍左右。因此，需要针对苹果的特点开发优质高效的发酵菌种(王娟和徐桂花 2006)。
1.2.2 缺少苹果酒酿造专用苹果品种
苹果酒的品质好坏与苹果的品种有着直接的关系，苹果酒的质量取决于其糖、酒度、酸、酚类、香气等物质的种类和含量(李记明等 2007)，苹果品种糖酸比及主要香气成分前体含量与风味品质之间直接相关(王海波等 2007)，而我国目前的苹果品种主要为鲜食型，尚没有酿酒专用苹果，这在很大程度上制约了我国苹果酒的发展(王娟和徐桂花等2006; 吴荣荣等 2010; 于爱梅等 2006)。
1.2.3 苹果酒风味调控研究滞后

针对前面所列的问题，一方面要选择适应性和产香性能好的菌株，另一方面还需要研究苹果原料成分调节机制和酵母细胞基因调控机理来改善苹果酒风味，这样既解决了苹果原料品种多样性所引起的香气前体物质含量不同这一问题，又可以通过基因工程调控苹果酒的香气和风味物形成。而我国在这方面的研究还远远落后于欧美等发达国家。因此，要适应我国苹果品种多样性局面，提升我国苹果酒加工业的发展水平，我们就需要着重研究苹果原料成分调节机制和酵母细胞基因调控机理对苹果酒风味的影响。

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第二章 苹果酒酵母 BAT2 基因敲除

香气和风味是评价苹果酒品质的重要指标，酵母菌在酒精发酵过程中，氨基酸通过Ehrlich途径生成的高级醇和高级酯是发酵酒最重要的香气和风味物质(Styger et al.2013)。而BAT（branched-chain aminotransferase gene）基因被认为是控制支链氨基酸代谢的首要基因，该基因经过转录、翻译后产生调控支链氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）转变为ɑ-酮酸的转氨酶（transaminase），完成支链氨酸进入Ehrlich路径（如图2-1）转化为高级醇等挥发性香气物质的关键的第一步(Dickinson et al. 2000; EdenandBenvenisty 1998; Hazelwood et al. 2008; Lilly et al. 2006; Pires et al. 2014; Rossouw et al.2008; Styger et al. 2011; Yoshimoto H. et al. 2002; Yvon et al. 1997; Zhang et al. 2013)。有报道认为BAT1基因主要在生物合成过程起重要作用，而BAT2基因在分解代谢过程中有着显著的作用，BAT2基因对支链醇、异丁酸和异戊醇等的生成量有很大影响(Styger et al.2011; Yoshimoto et al. 2002)，还有研究表明BAT2基因对酿酒酵母小规模发酵过程过程中产生的高级醇及全部的香气成分有着显著的影响(Lilly et al., 2006)。综上所述，BAT2基因与支链氨基酸底物的分解代谢有关，因此，当系统研究38号苹果酒酵母香气形成时，BAT2基因、支链氨基酸添加量以香气物质形成的关系时，必须首先获得38( BAT2)基因工程菌株。

本章以西北农林科技大学发酵动力学实验室通筛选和保存的产香浓郁的苹果酒酵母38 号菌为出发菌株，通过两种基因敲除技术敲除其 BAT2 基因，获得 38 号苹果酒酵母的 BAT2 基因缺失菌株 38( BAT2)，为后续研究 BAT2 基因对亮氨酸和异亮氨酸代谢的影响奠定基础。

2.1 材料与方法
2.1.1 菌株和质粒
质粒：pUG6为基因敲除载体（如图2-2），带有卡那霉素抗性基因，在细菌中对氨苄青霉素( Amp )有抗性，，在酵母细胞中对遗传霉素( G418 )有抗性，购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心；pMD 19-T Vector 购自Takara公司，用于基因克隆和测序。菌株：苹果酒酵母38号菌和大肠杆菌DH5α (用于基因克隆操作)，由本实验室保藏。
2.1.2 工具酶和试剂

（1）1.5× CTAB：称取1.5g CTAB，加入1.0M的Tris-HCl ( pH8.0 ) 75mL ，0.5M EDTA30mL，再加入61.4g NaCl，用去离子水定容到100mL，于121℃，20min高压灭菌备用。（2）50× TAE：Tris 121g，冰乙酸28mL，0.05mol/L Na2EDTA ( pH=8.0 ) 50mL 混合后，用去离子水定容至500mL贮存备用；1× TAE：取50×TAE贮存液10mL，加蒸馏水定容至500mL。（3）EB的配制( 10mg/mL )：称取10mg EB，加500μL无菌水使之完全溶解，再定容至1mL，避光保存。（4）10× TE( pH=7.5 )：取1mL1M Tris-HCl ( pH=8.0 )，200μL 0.5MEDTA( pH=8.0 )，用去离子水定容至100mL，121℃，20min高压灭菌备用。（5）1M LiOAc：称取10.2g 二水合乙酸锂，加入5mL去离子水使之完全溶解后，再定容至10mL，121℃，20min高压灭菌备用。（6）10× LiOAc ( pH=7.5 )：称取10.2g 二水合乙酸锂，加入5mL去离子水使之完全溶解后，用稀乙酸调节pH至7.5，再定容至10mL，用0.22μm滤头过滤除菌。（7）50% PEG4000：称取25g PEG4000，加入10mL去离子水使之完全溶解后，再定容至50mL，过滤除菌。（8）40% PEG4000：按50% PEG4000：10×TE ( pH=7.5 )：10×LiOAc ( pH=7.5 ) =8:1:1的比例配制。（9）X-gal ( 20mg/mL )：称取0.02g X-gal，用DMF定容到1mL，用铝箔封裹，贮存于- 20℃。（10）IPTG ( 200mg/mL )：在0.8mL蒸馏水中溶解0.2g IPTG后，用蒸馏水定容至1mL，用0.22μm滤头过滤除菌，贮存于-20℃。（11）蜗牛酶( 20mg/mL )：称取1g蜗牛酶，用去离子水定容至50mL，用0.22μm滤头过滤除菌。

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2.2 试验方法
2.2.1 苹果酒酵母38号菌株BAT2基因克隆、测序
2.2.1.1 苹果酒酵母38号菌株基因组总DNA的提取
将实验室筛选保藏的38号菌，活化后，使用YPD固体培养基进行平板划线，分离得到酿酒酵母38号单菌落，用接种环挑取单菌落接种于YPD液体培养基，28℃、120rpm过夜培养，用OMEGA公司的酵母DNA提取试剂盒进行DNA提取，具体按其操作说明书进行。
2.2.1.2 苹果酒酵母38号菌株BAT2基因的克隆及其测序
以提取的酿酒酵母38号菌基因组DNA为模板，用Fw-NotI、Rv-NotI这一对特异性引物进行PCR扩增BAT2基因，Fw-NotI、Rv-NotI结合的位置不在BAT2基因的开放阅读框架中，而在BAT2基因上下游1000bp的范围内。PCR反应体系如表2-3。PCR扩增程序为：（1）预变性：94℃，2min；（2）变性：94℃，20s；（3）退火：55℃，20s；（4）延伸：72℃，1min；（5）从（2）到（4）共40个循环；（6）延伸：72℃，10min。
在进行38号酵母BAT2基因敲除之前，首先要获得38号酵母的单倍体。酵母细胞一般是二倍体，往往有MAT α/MATα型、MAT a/MAT a 和MATα/MAT a三种交配型，从双倍体酵母细胞获得的单倍体细胞只能有MAT α或MAT a两种。单倍体制备的具体步骤如下：
（1）将本实验室筛选斜面保存的38号苹果酒酵母，于YPD固体斜面上培养48h进行活化，活化两次，然后接入产孢培养基（Macclary 培养基）；于25℃培养3天；
（2）用显微镜观察，在出现四分体时，用接种环刮下适量菌体于无菌水中，于4000rpm，室温离心5min,收集菌体；
（3）加入5mL无菌水洗涤，按上述条件离心收集菌体，再加入5mL0.5mg/mL的蜗牛酶( 贮存浓度为20mg/mL )，于37℃水浴20min，使孢子释放；
（4）按同样的条件离心收集酵母细胞，用2%的醋酸钾重悬，在漩涡振荡器上震荡30s，于4000rpm，室温离心5min，收集细胞；

（5）用5mPD液体培养基重悬菌体，在YPD平板上划线，28℃培养，挑取单菌落。

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第三章 BAT2 基因及亮氨酸和异亮氨酸添加量对两种氨基酸分解代谢速率的影响....47
3.1 材料与方法 ...................................................... 47 
3.1.1 试剂与材料 ....................................................... 47 
3.1.2 主要仪器 ........................................................ 47 
第四章 BAT2 基因、异亮氨酸或亮氨酸添加量对发酵产物中香气成分的影响........65
4.1 材料与方法 ....................................................... 65 
4.1.1 材料与仪器 ...................................................... 65 
4.1.2 试验方法 ................................................................ 66 
第五章 异亮氨酸与亮氨酸添加及 BAT2 基因敲除对苹果酒酵母支链转氨酶活性的影响....116

5.1 材料与方法 ................................................................ 116 

第六章 亮氨酸和异亮氨酸添加量及 BAT2 基因对苹果酒酵母葡萄糖消耗量的影响

6.1材料与方法
6.1.1 试剂及仪器
葡萄糖（分析纯）购于西陇化工股份有限公司；无水亚硫酸钠（AR）购自西安化学试剂厂；分析纯的氢氧化钠、酒石酸钾钠、重蒸酚购于北京索莱宝科技有限公司；3,5-二硝基水杨酸（AR）（3，5-二硝基水杨酸）购于上海科丰化学试剂有限公司。主要仪器为UV-1700型分光光度计（日本岛津公司）；HC-3018R型高速冷冻离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司。DNS显色试剂配制：称取2.5g的3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中，加入0.5g苯酚，再溶解0.075g亚硫酸钠、2.5g氢氧化钠和50g酒石酸钾钠，移入500mL容量瓶，定容至500mL，储存于棕色瓶并放置在冰箱中待用。1mg/mL的葡萄糖标准浓缩液：称取大于0.1g的葡萄糖置于热风干燥箱98℃干燥至恒重，准确称取0.100g葡萄糖，用蒸馏水溶解并定容至 100mL。
6.1.2 试验方法
6.1.2.1 DNS法测定葡萄糖方法的优化
（1）最佳吸收波长、最佳DNS试剂用量及反应时间、最佳加热时间的确定
A、最佳吸收波长确定：为了减少背景误差，以葡萄糖标准液-水(空白)为对照，除了对葡萄糖标准液-DNS试剂进行全波扫描外还对DNS试剂-水(空白)也分别进行全波扫描，综合确定最佳波长。
B、最佳DNS试剂用量及反应时间：准确加入0.5mL葡萄糖标准溶液于系列10mL试管中，分别加1.0、1.5、2.0、2.5mL的DNS试剂，沸水浴加热8min，流水冷却、定容。以水代替葡萄糖标准液作参比，在前面确定的最佳波长下测定不同显色时间：20、35、50、65、80、95min时的吸光度。

C、最佳加热时间：取葡萄糖标准液0.5mL于系列10mL试管中，分别加入DNS试剂XmL，置沸水浴中使之进行2min、5min、8min、11min、14min反应后取出，流水冷却，定容。以相同条件下不加葡萄糖标液作空白参比。在前面确定的最佳波长下测不同加热时间时溶液的吸光度。确定出最佳的加热时间。

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第七章 结论与展望

7.1 结论
本研究以实验室保存的一株苹果酒酵母 38 号为原始菌株，敲除了其 BAT2 基因获得了 38（ BAT2）基因工程菌株。以这两株菌为发酵菌，以添加 0.5M 和 1.0M 异亮氨酸或亮氨酸作为中心氮源进行发酵试验，通过 RP-HPLC 法分析了发酵 72h 内异亮氨酸或亮氨酸的消耗状况，通过 HS-SPME-GC-MS 法同步分析了氨基酸主要分解阶段的挥发性香气物质的变化规律，并运用 MM2 力场分析其中的关联代谢产物的代谢路径能量平衡和潜在方向，以 2，4-二硝基苯肼比色法分析了该阶段的转氨酶（BCAT）酶活，通过DNS 法分析了发酵 72h 内葡萄糖的消耗状况，通过对这些过程相关证据和变化规律进行分析得到以下结论。
（1）添加异亮氨酸或亮氨酸的 98%均被消耗在 12h 内，添加氨基酸的消耗速率与其添加初浓度成正比，表明氨基酸代谢有其信号传导和转运体系。
（2）BAT2 基因的缺失导致 38（ BAT2）菌株对异亮氨酸与亮氨酸的消耗速率低于原出发菌株 38 号，方差分析结果表明两种菌对添加氨基酸的消耗速率差异不显著，表明染色体的 BAT2 基因不是氨基酸消耗的主要调控基因，线粒体可能是氨基酸消耗的主要场所。
（3）GC-MS 同步分析异亮氨酸或亮氨酸消耗主要时间点发酵产物的结果表明添加异亮氨酸和亮氨酸发酵液中分别有 35 种和 33 种挥发性香气物质，BAT2 基因与异亮氨酸或亮氨酸联合协同调控一些代谢产物的产量。首先，两类发酵产物在物质种类上的区别是异亮氨酸分解依次产生了 2-甲基丁醛、2-甲基丁醇以及乙酸 2-甲基丁酯；亮氨酸分解依次产生了 3-甲基丁醛、3 甲基丁醇以及乙酸 3-甲基丁酯。其中乙酸 2-甲基丁酯是以前没有报道过的。第二，添加两种氨基酸的 12h 发酵产物中 2-甲基 1-丙醇产量均与氨基酸添加量呈正相关增加。第三，添加 Ile 或 Leu 的代谢产物的一个共同特点是香气物质中有许多关联代谢产物如 C8(辛醛、辛醇、辛酸、辛酸乙酯)、C9(壬醛和壬醇)、C10（癸醛、癸酸和癸酸乙酯）、C12（十二醛、十二醇和十二酸）、C14（十四醇、十四酸乙酯、十四酸异丙酯）、C16(十六醇、十六酸甲酯、十六酸乙酯和十六酸异丙酯)等，各代表一个完整的氧化还原平衡和能量平衡，其中醛转化为酸和醇为必然的氧化还原平衡并维持NAD+/NADH 的平衡，醇或酸再转化为酯的过程是一个储藏能量并进行能量平衡的过程。第四，谷氨酰胺是酵母细胞代谢大量氨基酸时脱氨的产物。
（4）BAT2 基因缺失时，酵母细胞的转氨酶活性必然降低，但降低不显著，这表明BAT2 基因不是氨基酸消耗的主要调控基因。

（5）与 Control 组相比，异亮氨酸或亮氨酸的添加均延缓了培养基中葡萄糖的消耗，达到残糖浓度的时间均推迟了大约 24h。

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参考文献（略）

本文编号：42418