葡萄查耳酮合酶基因克隆及表达分析

发布时间：2016-06-08 22:11

1 文献综述   

1.1 类黄酮的基本概况 
类黄酮类物质作为一种次生代谢物广泛存在于高等植物中，包括查耳酮、黄酮、异黄酮、花色素苷、黄烷酮、原花色素等六大类。相关的实验研究表明，类黄酮以保护性物质的身份存在于植物中，起着重要的生理作用，例如抵御病原菌侵害植物、在豆科植物形成根瘤菌的过程中协调植物与微生物的关系、减少紫外线对植物的伤害等等。类黄酮类物质在应用方面也具有重要功能，例如对动物血管具有软化功能、抑制癌症发生、机体内自由基的清除等生理功能，这些功能具有实际应用价值，已经是植物次生代谢物应用研究领域的焦点。多酚类化合物类黄酮，是普遍分布在各种不同植物体内的一大类低分子量次生代谢产物 ，它的基本结构式是 C6 - C3 - C6,通常被称作“黄烷核”，是一类三元环化合物[1]，由两个芳香环和一个杂环组成，母核结构由芳香环 A 和芳香环 B 通过中间 C 环相互连接而成 15 碳化合物[2]（如图 1.1）。在植物代谢中类黄酮化合物发挥着十分重要的生理作用。大自然中，植物体内的类黄酮类物质发挥及其重要的作用，许多的功能都与该物质的积累密切相关，类黄酮类物质与花、果实以及种子颜色的形成有关，其为主要的显色物质，促进色素形成，用来吸引传播花粉和种子的动物及昆虫； 参与豆科植物体的根瘤菌形成过程，能够有效提高农作物总产量[4]，带来更多的经济效益；调节植物生长素的运输，类黄酮化合物可以抑制生长素的转运[5]，通过与生长素极性运输抑制剂 NPA 竞争的方式；能够有效保护植物抵御紫外线伤害[6]。植物胁迫发生时,类黄酮化合物积累在植物器官中，它可以有效吸收UV 辐射光,从而减少对植物体内大分子（核酸、蛋白质等）的破坏作用,保护生物体的正常功能。例如栽培变种玉米与野生型玉米同时经 UV-B 辐射后，野生型玉米的 DNA损伤程度远大于栽培变种[7]。一项研究表明，拟南芥突变体植株与正常植株相比较，类黄酮化合物含量较高，能够抵抗大剂量的 UV 辐射胁迫[8]。同时，类黄酮是一类生物活性很强的化合物，是一种天然的抗氧化剂，能够有效清除体内的自由基(Free Reaical)及毒素，预防、减少疾病的发生[9]；不但具有减少心肌耗氧量功能，同时可以增加心肌供氧量，起到预防心脑血管疾病的功效；防治骨质疏松症；减轻更年期综合症[10]。 
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1.2  查耳酮合酶的研究概况及进展
查耳酮合酶（chalcone  synthaseCHS）是植物类黄酮代谢途径的入口酶，也是此途径的第一个关键限制酶。查耳酮合酶以来源于苯丙氨酸代谢途径的丙二酰辅酶 A (malonyl CoA)和香豆酰CoA(coumaryl CoA)为底物，催化其生成柚皮素查耳酮(narigenin chalcone)。值得注意的是在逆境条件下，查耳酮合酶的生理底物可以是咖啡酰辅酶 A（caffeoyl CoA）或肉桂酰辅酶 A(cinnamoyl CoA)[25]。植物中含有查耳酮合成酶, 其在很多生理生化活动中具有重要生理功能,近年来已经备受关注，成为植物生理生化和分子生物学研究的热点之一。研究表明，CHS 的功能主要表现在色素合成、防止紫外线伤害、能够有效抵御病原真菌侵染、参与豆科植物根瘤菌形成过程、促进花粉管生长、吸引昆虫和动物、调节生长素运输等方面[26]。在应用方面，类黄酮类物质具有软化血管、清除体内自由基、抗癌、防止骨质疏松等生理作用，已经成为植物次生代谢物应用研究的焦点[27]。  自 1983 年第一次从欧芹（Parsley）里克隆取得 CHS 以来,研究人员不断实验,随着研究不断拓宽，现在已经能够从苔藓类植物、裸子植物等多个物种中克隆了 CHS 基因的 cDNA  序 列  ,  涉 及 的 植 物 包 括 小 立 碗 藓 (Physcomitrella  patens)、 拟 南 芥(Arabidopsis)、地钱 (Marchantiapolymorpha)、 赤松(Pinus  densiflora)、大豆(Glycine max)、豌豆(Pisum satium)、矮牵牛(Petunia hybrida)、小麦(Triticum aestivum )、水稻(Orzysativa)、高粱(Sorghum bicolor)、玉米(Zea mays)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、翅叶决明(Cassia alata )、啤酒花(Humulus lupulus)、金鱼草（Zntirrhinum）、山茶(Camellia sinensis)、非洲菊(Gerbera  hybrid)、掌叶大黄(Rheum  palmatum)、虎杖(Polygonum cuspidatum)、蝴蝶兰（Phalaenopsis hybrida）、甜荞（Fagopyrum esculentum）、牡丹(Paeonia suffruticosa)、水母雪莲(Saussurea medusa)等[28]。 
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2 葡萄 CHS 基因的克隆以及生物信息学分析 

2.1 实验材料和仪器 
2.1.1 实验材料、试剂与耗材 
（1）葡萄品种：为种植的栽培种欧洲葡萄（Vitis vinifera）； 克隆载体：为 pEASY—T 1Simple Cloning Vector 购置于宝生物工程（大连）有限公司； 实验中所用 PCR 引物:购自生工生物公司； 实验中所用的酶:购自生工生物公司； DEPC(焦炭酸二乙酯)：购自生工生物公司； 琼脂糖：购自上海 Invitrogen 公司； 反转录试剂盒：购自上海 Invitrogen 公司； 胶回收试剂盒：购自北京 TIANDZ 公司； E.coli DH5α：为本实验室原始保存原菌。 
（2）所需耗材：将 1.5ml  Eppendorf  tube 浸泡在盛有 1‰DEPC 水的桶中，将其置于储藏柜中进行过夜处理，次日取出，用报纸包好，在灭菌锅中高温高压灭菌 40min，80℃烘干 3 后取出备用。研钵、研杵、镊子、药匙、药瓶、移液管等洗净，将物品外面包被一层锡铂纸，将烘箱温度调至 180℃，，烘烤 3-5 小时。      
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2.2 实验方法
在 TIGR 基因索引数据库里，以 Grape 和 chalcone synthase 两个关键词语进行搜索，搜索到具有同源性 VvCHS 基因所有 EST 序列。根据已报道的蝴蝶兰、苦荞、蓝莓等其他物种中查耳酮合酶基因序列长度在 1140bp—1200bp 之间为参考，选择长度合适的序列。对得到的序列利用 NCBI 的 ORF  Finder程序进行 ORF 预测，去除大部分重复的 CHS 基因，再筛选掉开放阅读框不符合的 EST 序列，经分析比对，拿到五个具有符合条件的基因序列。利用 NCBI 中的 CD  Search程序预测序列是否具有 CHS 保守结构域，在葡萄基因组数据库中，将 5 个序列进行定位，确定其确实为葡萄中序列，并对其中 VvCHS1 和 VvCHS3 进行基因克隆。
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3 葡萄 CHS 基因在不同处理条件下的诱导表达 ......... 46 
3.1  材料处理 ........... 46 
3.2 RNA 的提取、纯化及 cDNA 的合成 ...... 46 
3.3  引物设计 ........... 46 
3.4  实时荧光定量 PCR .......... 46 
3.5  结果 ........... 47 
3.5.1  葡萄 RNA 电泳检测 ..... 47 
3.5.2  实时荧光定量 PCR ....... 48 
3.6  讨论 ........... 49 
4 结论 ....... 50 

3 葡萄 CHS 基因在不同处理条件下的诱导表达 

3.1 材料处理 
（1）紫外线处理
将紫外灯置于叶片上方 20cm 处，强度为 2w/m2 ，相应剂量为 1.2KJ/m2。照射时间：10 分钟，避光。将植株遮光，处理的叶片用锡箔纸包好。紫外处理后：0h、2h、4h、8h、12h、24h 和 48h 时剪取叶片，依次编号，迅速冻于液氮中，保存于-80℃冰箱待用。 

（2）水杨酸处理
常温下，用 10-5M SA 溶液涂抹葡萄叶片，在喷施后 0h、2h、4h、8h、12h、24h 和48h 时剪取叶片，依次编号，迅速冻于液氮中，保存于-80℃冰箱待用。

葡萄叶片经过紫外线辐射和水杨酸喷洒后，VvCHS1 和 VvCHS3 基因相对表达量发生了不同程度变化，实时荧光定量 PCR 结果显示：两者在不同处理条件下均在 12h 以前呈现上升趋势，在 12h 时表达量最大，随后缓慢下降（图 3.2）。实验结果表明：VvCHS 基因的表达受外界环境因素影响，紫外线辐射和水杨酸喷洒胁迫处理条件下，导致 CHS 基因的表达相关元件得到响应，并启动表达机制，且受刺激部位优先积累查耳酮。本实验对葡萄叶片进行 UV 处理，结果显示,CHS 基因表达量增加。水杨酸是生物体内的信号传递分子，在植物防御病毒、提高其非生物抗逆性等方面起重要作用,被认为是启动植物体防御机制的信号分子，本实验对葡萄叶片进行 SA 处理，结果显示,CHS 基因表达量增加。 

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结论 

根据实验研究结果，得出了以下结论：
1.本实验采用 RT-PCR 技术，从葡萄中成功克隆得到两个 CHS 基因的 cDNA 开放阅读框（ORF）序列 VvCHS1、VvCHS3。其中，VvCHS1 序列长 1182bp，编码 393 个氨基酸；VvCHS3 序列长 1170bp，编码 389 个氨基酸。
2.从 TIGR 基因索引数据库和葡萄基因组数据库中经检索后分析，最后确定了 5 个具有完整 ORF 区和保守结构域的葡萄 CHS 基因。利用软件对 5 个 VvCHS 基因进行了基础生物学预测分析。包括保守结构域、编码氨基酸组成、一级结构及理化性质、二级结构、高级结构、启动子所含的顺式作用元件和系统发生等方面。系统发生分析结果表明两个 VvCHS 基因编码的氨基酸虽然属于同一大组，但分属于第一大组的不同亚组，这表明基因在进化中产生了歧化，形成了植物 CHS 的多样性。      
3.采用实时荧光定量 PCR 技术，对 VvCHS1 和 VvCHS3 在不同处理条件（如 UV 和SA）下的相对表达量进行了分析。VvCHS1 和 VvCHS3 在受到 UV 和 SA 不同时间处理条件下，其相对表达量都发生了不同程度的变化，呈先上升后缓慢下降趋势，且表达量最高出现在 12h 处。葡萄叶片在被 UV 辐射和喷洒 SA 后，VvCHS1 和 VvCHS3 表达量的变化趋势大体一致。实验结果说明 VvCHS1 和 VvCHS3 参与植物逆境胁迫响应途径。 
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参考文献(略)

本文编号：54924