低温纤维素酶高产菌筛选和酶学性质研究

发布时间：2023-08-06 16:54

　　我国是秸秆生产大国,每年产生秸秆10亿吨以上,这些秸秆大部分被废弃或者被焚烧,造成严重环境污染和资源浪费。在低温条件下,微生物活性降低,耐低温菌则可以在低温寒冷的环境下仍保持较好的生物降解能力,因此寻找和开发耐低温秸秆降解微生物对于低温寒冷地区秸秆还田、秸秆肥料化等具有重要意义。本研究从吉林省长白山苔原带土样中筛选到一株耐低温并高产纤维素酶的菌株,鉴定后对该菌株进行了诱变,筛选得到一株高产低温纤维素酶突变菌株7a-22,进一步对该突变株的培养条件、遗传稳定性、低温下产纤维素酶的分子量以及酶学性质等方面开展了研究,测定了低温条件下,该突变株(纤维素)的秸秆转化效率,具体结果如下:1.经形态学观察、生理生化指标测定及系统进化分析,鉴定该菌株为莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi),命名为7a-3。2.利用常温常压等离子诱变与紫外诱变复合技术(ARTP-UV)对该菌株进行诱变,高通量筛选后得到了一株高产纤维素酶的突变株7a-22,纤维素酶活力达到4.73±0.09 U/m L,相比较原始菌株7a-3的2.94±0.12 U/m L提高了60.88±0.25%,传代10次后,酶活力...

【文章页数】：69 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 文献综述
    1.1 纤维素酶的研究进展
        1.1.1 纤维素酶的组成
        1.1.2 纤维素酶的应用
        1.1.3 纤维素酶的生产方式
        1.1.4 产纤维素酶的微生物
    1.2 低温产纤维素酶微生物的研究进展
        1.2.1 低温产纤维素酶微生物的研究现状
        1.2.2 低温假单胞菌研究进展
    1.3 物理诱变育种的应用
        1.3.1 ARTP诱变技术在微生物中的应用
        1.3.2 紫外诱变技术在微生物中的应用
    1.4 研究目的与意义
    1.5 技术路线
第二章 低温产纤维素酶细菌的筛选与鉴定
    2.1 材料与方法
        2.1.1 样品来源
        2.1.2 实验培养基
        2.1.3 实验试剂
        2.1.4 实验仪器
        2.1.5 菌种富集
        2.1.6 葡萄糖标准曲线的制作
        2.1.7 高产纤维素酶耐冷菌株的筛选
        2.1.8 纤维素酶活(CMCase)测定
        2.1.9 菌株电子显微镜观察
        2.1.10 不同温度最适生长温度的测定
        2.1.11 高产纤维素酶的细菌初步鉴定
        2.1.12 16S rDNA序列分析与系统进化树的构建
    2.2 结果
        2.2.1 菌落的富集
        2.2.2 葡萄糖标准曲线
        2.2.3 高产纤维素酶耐冷菌株的初筛
        2.2.4 纤维素酶活(CMCase)测定
        2.2.5 电子显微镜观察菌株
        2.2.6 不同温度下7a-3的最适生长温度的测定
        2.2.7 7a-3生理生化指标鉴定
        2.2.8 16S rDNA序列分析与系统进化树的构建
        2.2.9 假单胞菌7a-3的16S rDNA序列
    2.3 讨论
    2.4 小结
第三章 莓实假单胞菌7a-3的诱变育种
    3.1 材料与方法
        3.1.1 实验菌株
        3.1.2 实验培养基
        3.1.3 实验试剂
        3.1.4 实验仪器
        3.1.5 菌种活化
        3.1.6 常温等离子(ARTP)诱变
        3.1.7 致死率曲线测定
        3.1.8 正向突变菌株的筛选
        3.1.9 紫外诱变
        3.1.10 致死率曲线测定
        3.1.11 正向突变菌株筛选
        3.1.12 纤维素酶活力检测
    3.2 结果
        3.2.1 等离子诱变致死率曲线
        3.2.2 等离子诱变正向诱变菌株的筛选
        3.2.3 紫外诱变致死率曲线
        3.2.4 紫外诱变正向诱变菌株的筛选
        3.2.5 正向突变菌株遗传稳定性研究
        3.2.6 正向突变菌株与出发菌株产酶能力对照
    3.3 讨论
    3.4 小结
第四章 突变株7a-22的碳源与氮源优化
    4.1 材料与方法
        4.1.1 实验菌株
        4.1.2 实验培养基
        4.1.3 实验试剂
        4.1.4 实验仪器
        4.1.5 突变菌株7a-22最适温度测定
        4.1.6 突变菌株7a-22生长曲线及酶活力测定
        4.1.7 碳源种类的优化
        4.1.8 氮源种类的优化
        4.1.9 正交实验
        4.1.10 菌株7a-22对葵花秸秆结构的变化
        4.1.11 菌株7a-22对葵花秸秆成分的影响
        4.1.12 秸秆失重率测量
    4.2 结果
        4.2.1 突变菌株7a-22最适温度
        4.2.2 突变菌株7a-22生长曲线及酶活力测定
        4.2.3 碳源种类的优化
        4.2.4 氮源种类的优化
        4.2.5 正交实验结果
        4.2.6 菌株作用后秸秆结构的变化
        4.2.7 菌株发酵对秸秆成份的影响
        4.2.8 菌株发酵对秸秆失重率的影响
    4.3 讨论
    4.4 小结
第五章 低温纤维素酶的酶学性质分析
    5.1 材料与方法
        5.1.1 实验菌株
        5.1.2 实验培养基
        5.1.3 实验试剂
        5.1.4 实验仪器
        5.1.5 低温纤维素酶的纯化
        5.1.6 蛋白质标准曲线的绘制
        5.1.7 粗酶液中蛋白质含量的测定
        5.1.8 温度对纯化后低温纤维素酶活力的影响
        5.1.9 纯化后低温纤维素酶的热稳定性
        5.1.10 pH对纤维素酶活力的影响
        5.1.11 低温纤维素酶pH的稳定性
        5.1.12 低温纤维素酶的动力学研究
    5.2 结果
        5.2.1 测定蛋白质标准曲线
        5.2.2 硫酸铵对纤维素酶影响
        5.2.3 低温纤维素酶纯度鉴定
        5.2.4 温度对低温纤维素酶活力的影响
        5.2.5 pH对低温纤维素酶的影响
        5.2.6 低温纤维素酶的热稳定性
        5.2.7 低温纤维素酶的pH稳定性
        5.2.8 低温纤维素酶动力学常数测定
    5.3 讨论
    5.4 小结
第六章 低温纤维素酶基因克隆和蛋白质结构模拟
    6.1 材料与方法
        6.1.1 实验菌种
        6.1.2 实验培养基
        6.1.3 实验试剂
        6.1.4 实验仪器
        6.1.5 比较7a-3和7a-22的纤维素酶系三种酶活
        6.1.6 总DNA提取
        6.1.7 引物的设计
        6.1.8 bglX基因克隆及序列分析
        6.1.9 BglX蛋白的理化性质
        6.1.10 BglX蛋白跨膜结构分析
        6.1.11 BglX蛋白质的结构预测
    6.2 结果
        6.2.1 7a-3和7a-22的纤维素酶中三种酶酶活提高率
        6.2.2 总DNA提取
        6.2.3 纤维素酶基因的克隆和序列分析
        6.2.4 BglX蛋白质序列分析
        6.2.5 BglX蛋白的理化性质
        6.2.6 BglX蛋白的跨膜结构、信号肽分析
        6.2.7 BglX基因编码蛋白的二、三级结构预测
    6.3 讨论
    6.4 小结
结论
参考文献
作者简介
致谢



本文编号：3839699