毒死蜱和乙草胺复合污染对热带爪蟾胚胎的致畸效应与分子机制初探

发布时间：2016-10-02 06:59

1 文献综述

国内也有不少研究毒死蜱与化合物对生物的复合污染，主要是研究复合污染对生物的毒性评估、毒性效应以及对生物标志物的影响等。如同为有机磷农药的毒死蜱与乐果联合染毒增加大鼠肝脏 SOD、CAT 两种抗氧化酶的活性以及过氧化物 MDA 的浓度，联合作用表现为相加[5]。赵于丁等发现毒死蜱与氟虫腈等 4种农药混合能对斑马鱼的乙酰胆碱酶、P450 酶、谷胱甘肽-S-转移酶有不同的指示作用，如诱导 GST 活性等，达到良好的检测效果[6]。付瑶等发现毒死蜱与阿特拉津联合暴露对鲤鱼的亚慢性效应时的肝组织出现病理变化，肝、鳃的自由基活性与过氧化酶的活性变化影响机体正常的生理机能，具有毒性作用[7]。文一等研究了毒死蜱与氧化乐果混合污染使 SD 大鼠的精子出现多种畸形现象，导致精子质量降低，对细胞造成损伤，对大鼠的生殖毒性与神经毒性具有协同作用[8]。国内研究对乙草胺的复合污染对脊椎动物的报道较少，但对微生物与蚯蚓有少量的报道。梁继东等人发现不同浓度的 Cu 与乙草胺混合对赤子爱蚯蚓的毒性变化不一，高浓度的增加毒性作用，提高了土壤生态系统的毒性[9]。张惠文等学者同样发现 Cu 与乙草胺的复合污染具有相加作用，对土壤的呼吸强度与酶活性产生影响[10]。马爱军等人发现毒死蜱与乙草胺复合污染抑制土壤中微生物过氧化氢酶活性，对土壤微生物中的生物碳量随着时间不同发生变化[11]。

........

2 农药毒死蜱、乙草胺对热带爪蟾胚胎的致畸效应

2.1 前言

随着农药产业的迅速发展和大面积的推广使用，其污染效应也扩展到整个生态系统。研究表明，所施除草剂20%以上会长期残留在土壤中，杀虫剂的10%-20%会附着在作物表面，大部分残留通过降雨、沉降、径流进入河流湖泊。毒死蜱（Chlopyrifos）是我国最主要的杀虫剂的品种，使用量大。有研究显示毒死蜱可以影响 Rhinella arenarum 胚胎发育和其体内的多胺的代谢[37]；同时有研究得知，大量的毒死蜱残留影响墨西哥钝口螈早期的胚轴分化，导致胚胎畸形[97]。乙草胺（Acetochlor）属于酰胺类除草剂，其原药在我国使用量已超过 107kg。有报道显示，乙草胺从地表水、地下水，甚至在饮用水中也被频繁地检测出来，对人体健康存在潜在的基因毒性，对水生生物和食草鸟类有较高的风险[98]。近几年，全球两栖动物种群衰退的现象十分严重，一些化合物被认为是重要的污染源[99]。据此，本章选用毒死蜱、乙草胺对热带爪蟾胚胎进行单一及联合暴露，研究其对热带爪蟾的致畸效应，为探索污染物对两栖类种群的影响提供科学依据，也为后续的致畸机制的研究提供一定的理论依据。

2.2 材料与方法

热带爪蟾成蛙（Xenopus tropicalis）购于浙江大学生命科学院。成蛙雌雄分开饲养，实验室内构建水循环系统，水循环系统的自来水经过活性炭柱和微孔过滤系统，溶解氧≥5mg/L,余氯<3μg/L，pH 控制在 7.0-8.0。饲养过程中水温控制在26±2℃，光暗比为 12h：12h。喂食采用冰冻的红虫或牛肝，隔天喂食，喂食完之后进行 2 小时紫外灯消毒。挑选多对性成熟的热带爪蟾，进行人工注射 HCG 的方法诱导产卵。待热带爪蟾抱对产卵结束后，收集胚胎。在显微镜下挑选发育健康的胚胎、发育阶段一致（NF10-11 阶段）的胚胎，用 2%的 L-半胱氨酸溶液进行脱膜，脱膜的时间大概需持续 2h-3h。

2 农药毒死蜱、乙草胺对热带爪蟾胚胎的致畸效应…………11

2.1 前言…………11
2.2 材料与方法………11 
2.3 数据处理……………14
2.4 实验结果………………14
3 毒死蜱、乙草胺复合污染对热带爪蟾胚胎致畸机制的初探………………43
3.1 前言…………43
3.2 材料与方法…………43 
3.3 数据统计与分析………47
3.4 试验结果……………47 
4 全文总结………….57
4.1 结论………………………………57
4.2 不足与展望……………58

3 毒死蜱、乙草胺复合污染对热带爪蟾胚胎致畸机制的初探

3.1 前言

HOX 基因（Homeobox genes），是哺乳类动物的同源异型盒基因的其中一类基因，成簇的排列在不同染色体上，按照胚胎发育期的前-后轴方式表达[70]。该家族基因属于发育基因，对生物体的发育有时间和空间的调控，其对胚胎组织与器官的形成具有重要的调控作用，尤其是对动物体节与体型的发育[113,114]。从而可以得知，脊椎动物的肢体发育与 HOX 基因密不可分。有研究指明，脊椎动物胚胎的前后轴分化主要由 HOX 基因决定[115]。HOXA3 主要是控制脊椎动物的头部发育，HOXA11 与 HOXA13 主要是调节骨骼的形成，主要表达是在胚胎发育的后期。本实验中运用实时荧光定量 PCR（Real-Time PCR）的检测方法，研究 FETAX急性毒性实验中毒死蜱、乙草胺单一及复合污染下不同时段对热带爪蟾胚胎的HOXA3、HOXA11、HOXA13 基因表达差异的影响，探讨农药毒死蜱、乙草胺对胚胎的致畸效应及其机制。

3.2 材料与方法

挑选大小一致、颜色均一的胚胎进行实验，将胚胎暴露在 12 孔板中，每个孔板放置 2 颗胚胎卵，实验设三个重复。热带爪蟾胚胎分别染毒于 4 组试剂中：毒死蜱单剂浓度 0.1，0.2，0.4，0.8，1.6mg/L，乙草胺单剂 0.5，1，2，4 mg/L中，毒死蜱致畸中浓度（0.4327 mg/L）与乙草胺一系列浓度 0.5，1，2，4 mg/L的混剂中，乙草胺致畸中浓度（2.70mg/L）与毒死蜱一系列浓度 0.1，0.2，0.4，0.8，1.6mg/L 的混剂中。实验过程中挑出死亡的胚胎，分别收取 48h 与 96h 的每个浓度的存活胚胎，用于提取胚胎的总 RNA，为后续的荧光定量 PCR 分子实验做准备。若不及时做分子实验，也可先将收集的胚胎用液氮保存在-70℃冰箱中。

....

4 全文结论

4.1 结论

本文以热带爪蟾胚胎作为研究对象，比较研究了毒死蜱、乙草胺单一及农药毒死蜱-乙草胺复合污染96h 对胚胎的急性毒性以及致畸的影响，得到了致畸中浓度 TC50、死亡率、致畸率的变化。在从形态学上，观察到了四种典型的畸形表型。当胚胎暴露 72h 后，取典型的致畸胚胎样品固定做组织切片，从组织水平更进一步的阐述了观察到的致畸表型以及发现胚胎新的组织病理变化。最后运用荧光定量 PCR 的方法，检测两种农药单剂及联合暴露下胚胎 48h 与 96h 对基因HOXA3、HOXA11、HOXA13 表达量之间的差异，从分子水平解释其对胚胎的致畸机制。本论文得出的实验结果与结论，主要概括为以下几点：1、热带爪蟾胚胎在毒死蜱、乙草胺 FETAX 急性毒性实验中，得出其致畸中浓度 TC50分别为 0.4327、2.70mg/L，毒死蜱与 2.70 mg/L 乙草胺复合污染的TC50为0.3493 mg/L，乙草胺与 0.4327 mg/L 毒死蜱复合污染的 TC50为 1.06 mg/L。从所得 TC50数值表明，胚胎在毒死蜱与乙草胺单剂暴露下 96h 的 TC50大于其两种不同比例复合污染的值，表明复合污染对胚胎的致畸毒性强于单剂暴露。胚胎分别暴露在毒死蜱、乙草胺单剂 96h，两者的致畸率都随着浓度的增加而升高，呈显著的剂量效应关系。从 FETAX 试验结果可以得出，毒死蜱、乙草胺为两种典型的致畸化合物。

4.2 不足与展望

1、在 FETAX 实验过程中，，对热带爪蟾胚胎畸形表型观察过程中还不够全面，不够系统，需进一步加强。在组织切片实验中，本论文取了典型的致畸样品进行观察试验，如可以，可从低浓度到高浓度对每类畸形表型进行切片观察，然后进行畸形表型的等级划分，能更加直观、系统的分析药物在不同浓度作用下对胚胎造成的组织病理变化，为后续的致畸机制实验提供更准确的方向。2、本论文选取了与胚胎发育相关的三个 HOX 基因，HOXA3、HOXA11、HOXA13。在毒死蜱、乙草胺单一及复合污染处理组中，虽发现这三个基因表达差异与观察到的畸形表型有关，但还需对 HOXA3、HOXA11、HOXA13 的具体的调控机制进行研究，这样对胚胎的发育会具有更深的研究意义。

..........

参考文献（略）

本文编号：128481