烟草中农药多残留色谱分析方法研究
第一章 文献综述
烟叶在种植、烘烤、仓储、加工等过程中极易受到病虫害的侵染。2002年，中国烟叶生产购销公司调查发现，花叶病、蚀纹病、马铃薯Y病毒病、黑胫病、赤星病等68种烟草侵害性病害以及烟蚜、烟青虫等害虫对烟叶危害较为严重。2007年，烟草全国病虫害发生面积达到83.15万公顷，直接产量损失高达9.4万吨(赵百东 2012)。因此，农药的使用必不可少。烟叶中农药的残留是消费者普遍关心的问题，国际烟草科学研究合作中心(CORESTA)农用化学品咨询委员会(ACAC)在2003年提出了烟草农药残留最高指导性限量，其中对99种农药的残留限量做了规定，2008年的第二版扩展至118种(CORESTA2008)，2013年的第三版中扩展至120种(CORESTA 2013)。除此之外，目前国际上已有29个国家及地区(包括14个欧洲国家、9个亚洲国家或地区、4个非洲国家以及1个北美国家)对烟草农残提出了限量要求。因此，建立高灵敏度、高选择性、更快速、更可靠的烟草农残检测方法十分必要。
1.1.1 烟叶农药残留现状
1.1.1.1 农药及其使用简介
农药是农业生产所使用药剂的总称，又称为农用化学品(Agricultural chemicals,Agrochemical)或作物保护剂(Crop protection agents，CPA)。中国地理环境和气候条件复杂，农作物品种以及病虫草鼠害种类很多，每年发生的受害面积达到 30 多亿亩。因此，农药作为一种重要的病虫害防治手段，能够更加快速、有效、经济地防治有害生物，可以确保农业丰收，在生产中推广应用农药，可挽回数倍乃至数十倍的经济效益损失。中国是农药的生产和使用大国，我国每年农药的生产量已经达到了 265 万吨(王茂华等2012)，其中杀虫剂 71.1 万吨，占总产量的 26.9%；杀菌剂 15.2 万吨，占总产量的 5.7%；除草剂 117.3 万吨，占总产量的 44.3%。2013 年 1-12 月中国累计生产化学农药 318.95万吨，比 2012 年同增长了 1.64%。
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农药残留分析是指利用现代技术对食品及环境当中存在的含量水平为微量、痕量以及超痕量的残留于其中的农药成分进行定性及定量检测。农残分析的困难程度较高。首先，食品、烟草、环境当中残留农药的浓度水平极低，一般在 ng、pg 甚至 fg(10-9-10-15g)级别，需要对残留农药的性质以及各种分析方法有深刻的理解，否则容易造成误判；其次，农药种类繁多，农民在各种农作物种植过程中选择农药的范围较大，且各地区使用的农药都有较大差异性，因此，分析的目标物质的不确定性较为突出，极大地增加了分析的难度；另外，不断有新的农药投入市场，分析的方法也需要不断更新。
根据分析目标物的种类及数量，农残分析方法分为两种类型，，分别是单残留方法、多残留方法。单残留方法指的是针对某一种农药进行定性及定量分析，一般用于农药注册登记时进行的相关分析，如最大残留限量制定、具有特定目的农药分析或性质研究。例如，利用气相色谱法(GC)检测新鲜烟叶或烤烟中的菌核净成分的方法便是属于单残留方法(Liu et al. 2007)；多残留分析方法指的是一次分析两种或两种以上农药种类的分析方法，这种分析方法也可以进一步细分，例如，只分析同一类农残的分析方法，这种方法又被称为选择性多残留方法(Selective multi-residue methods)，如 Vagi et al.(2007)等建立的利用超声波辅助提取结合 GC-ECD 检测海洋沉积物中的有机氯农药残留方法；另一种多残留方法为一次分析多类及多种农药残留，也被称为多类多残留方法(Multi-classmulti-residue methods)，如 Golge et al.(2015)所建立的利用液相色谱-串联质谱联用(LC-MS/MS)分析橙子中 115 种农药残留的方法。除此之外，目前发展的分析方法还包括同时用于分析农残、环境污染物、添加剂等多种有害成分的方法(Han et al. 2014)。由于农残含量水平极低，不同的分析方法可能会造成分析结果有所差异。为减少误差，需要对分析过程进行优化。图 1-1 表示一般农残分析的步骤及具体操作。目前，农残分析方法种类很多，但基本步骤包括样品采集及储存、样品前处理、样品分析及数据分析四个部分。其中样品前处理过程及样品的分析过程是农残分析方法的关键环节。
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第二章 烟叶中农药多残留的 GC/MS/MS 分析方法建立
烟叶中农药残留问题已经受到了消费者以及烟草加工行业的广泛关注，农药多残留分析方法的建立是实现烟叶安全品质高效监管的必要条件。由于烟叶中农药残留水平较低，一般在 ng 级别，因此，建立超灵敏度(LOQ<50 ng/g)和高选择性的检测方法很有必要。近些年来，样品的前处理技术如超声波辅助提取技术、固相萃取技术、加速溶剂萃取技术、QuEChERS 技术等已有很大进步，使得烟叶农残的分析更加快速、高效。分析仪器的发展更为分析领域带来了便利，例如，气相色谱(GC)或液相色谱(LC)与质谱检测器(MS)的联用，甚至与三重四级杆串联质谱(MS/MS)的联用，使分析仪器的灵敏度与选择性大大提高。
QuEChERS 是一种目前较为流行的农残检测样品前处理方式，由英文单词 quick、easy、cheap、effective、rugged 以及 safe 六个单词的首字母缩写，该方法由 Lehotay 小组于 2003 年建立，是农药残留分析领域中发展最快的方法之一，具有快速、简便、成本低廉、高效、适应性强以及操作安全等优点。利用这种方法所得到的待检样品可以同时用于液相色谱或气相色谱分析。十几年的发展过程中，该方法已经有了许多不同的版本。研究人员通过对其中目标物提取方法、基质成分净化等各个环节进行调整，并将其广泛用在了水果、蔬菜、茶叶、烟叶中农残的分析当中(王连珠 2012；郭春景 2013；陈建彪 2013；张媛媛 2014)。除此之外，利用这种方法所分析的目标物也已经突破了农药残留的领域，如对重金属、真菌毒素、环境污染物等成分的分析。对于 QuEChERS 方法来说，无水硫酸镁、氯化钠、醋酸盐等盐类成分在待检液脱水环节中的使用十分普遍，然而，这些盐类成分在待检液中的残留容易沉积在质谱检测器离子源表面，从而降低质谱检测器的信号提取性能。Gonzalez-Curbelo et al. (2014)研究利用氯化铵、醋酸铵、甲酸铵等盐类作为盐析主要成分，较好地解决了这个问题。该方法在烟叶农药残留分析中是否同样适用值得进行深入研究与探讨。另外，分析物保护剂(Analyte protectants, APs)已经被用在水果(苹果、柠檬)、蔬菜(西兰花)及谷物(小麦)农残成分分析当中(许秀丽2012；黄宝勇 2006；柴剑荣 2013)，对基质效应有较好的消除作用，但在烟草农残分析过程中还未使用。
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2.2.1 材料与方法
2.2.1.1 材料与试剂
所有待分析农药标准品混合标准储备液(共分为 10 组，每组待分析物浓度为 100μg/mL)及三苯基磷酸酯(TPP，内标，浓度为 20 μg/mL)购买于美国安捷伦公司，于-20 ℃冰箱中保存；敌菌丹、二溴磷以及杀线威标准品购买于德国 labor Dr.Ehrenstorfer-Schafers公司；乙腈、甲苯(HPLC 级)等有机溶剂购买于韩国 Duksan 公司；3-氧乙基 1, 2 丙二醇、谷洛糖酸内酯、D-山梨醇以及莽草酸(纯度均大于 95%)购买于美国 Sigma-Aldrich 公司；柠檬酸钠、醋酸钠(纯度均大于 95%)购买于天津津东天正公司；甲酸铵、乙酸铵(纯度均大于 95%)购买于美国 ACROS 公司；硫酸镁购买于天津科密欧公司；50mL 离心管及盐析包(内含 1 g 柠檬酸钠、0.5 g 柠檬酸氢钠、4 g 无水硫酸镁和 1 g 氯化钠)试剂盒，以及2mL 离心管(内含 150 mg 无水硫酸镁、25 mg PSA)购买于美国安捷伦公司；空白烟叶样品来自于国家烟草质量监督检验中心。
2.2.1.2 仪器与设备
GC/MS/MS(美国，安捷伦)装置由一套气相色谱仪(型号：7890B)以及一套三重四级杆串联质谱装置(型号：7000C)构成，并配置一套自动进样器(型号：7693)。气相色谱仪(GC-2010 plus)，安装 PTV 进样器；色谱柱采用 DB-5MS 柱(美国，安捷伦。长 30 m、内径 0.25 mm、膜厚 0.25 μm)；3-30K 冷冻离心机(德国，Sigma)；EOFO-945066 型多管式涡旋仪(美国，Talboys)；BSA224S-CW 电子天平 (德国，Sartorius)；Milli-Q 超纯水系统 (美国，Millipore)。
2.2.1.3 标准溶液的配置
混合标准工作液的配制：从-20 ℃冰箱中取出 10 组混合标准储备液，待温度上升至常温后，从每只混合标液小瓶中吸取标准溶液200 μL至棕色容量瓶中，用乙腈：甲苯(2:1，v:v)混合溶液定容至 10 mL，混匀后转移至 12 mL 棕色瓶中待用。
分析物保护剂的配制：天平称取 3-氧乙基 1, 2 丙二醇 100 mg、谷洛糖酸内酯 10 mg、D-山梨醇 10 mg 以及莽草酸 5 mg 至 10 mL 容量瓶中，用乙腈：水(4:1，v/v)混合溶剂溶解(水的作用是促进极性分析物保护剂溶解)。
系列标准溶液配制：准确移取 5 μL、10 μL、25 μL 、50 μL、100 μL、250 μL、500μL 混合标准工作溶液，置于 10 mL 容量瓶中，每个容量瓶中加入内标工作液 100 μL，用乙腈：甲苯(2:1，v/v)溶液定容，即得系列标准工作溶液，具体浓度为：1 μg/L、2 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L，50 μg/L，100 μg/L，200 μg/L。
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3.1 前言............................................................ 55
3.2 试验部分.......................................................... 56
第四章 UPC2同时检测溴氢菊酯和四溴菊酯研究.............................79
4.1 前言............................................................ 79
4.2 试验部分........................................................ 80
第五章 UPC2在烟叶除草剂检测中的应用..................................86
5.1 前言......................................................... 86
5.2 试验部分..................................................... 87
第五章 UPC2在烟叶除草剂检测中的应用
除草剂是一类用于抑制杂草生长的农用化学品，应用除草剂可以有效增加作物产量，并节约劳动力(Li et al. 2011; Liao et al. 2013; Zhao et al. 2009)。由于具有高残留毒性及其超量使用问题，除草剂已经开始被广泛关注(Liao et al. 2013)。由于烟叶具有较大的比表面积，与其他作物相比，烟叶具有更加严重的残留风险(Ferris et al. 2011)。除草剂属于内吸性农药，一旦与人体接触，其很容易被皮肤及衣物等吸收，从而导致持久及重复地暴露问题(Li et al. 2011)。而且，在烟叶的后期加工过程中，除草剂并不能够被完全去除。这样，此类化合物就会很容易进入吸烟者及其周围人体内，进而增加健康危害(CORESTA2013)。国际烟草科学合作组织已经分别对敌草胺，甲草胺，精喹禾灵，双苯酰草胺，异丙甲草胺及异噁草酮等 6 种除草剂的最大残留量进行了限定，具体为 0.1 mg/kg，0.1mg/kg，0.2 mg/kg，0.25 mg/kg，0.5 mg/kg，0.2 mg/kg (Yang et al. 2013)。因此，烟叶中除草剂的衡量测定及监控方法的发展与建立是非常重要的。
为减少除草剂对人体的危害性，目前，许多可靠的检测方法如气相色谱(Liao et al.2013; Zhao et al. 2009)及液相色谱(Zhang et al. 2011)等被建立并用于实际样品的分析。而且，多种检测器如电子捕获检测器(ECD)、火焰光度检测器 (FPD) (Zhao et al. 2008)、二极管阵列检测器(PDA) (Rahman et al. 2012)以及单级及串联质谱(MS、MS/MS)(Ferris etal. 2011; Lan et al. 2014)被安装至色谱仪以获得较好的仪器分析效果。尽管这些检测器具有较好的选择性或灵敏度，要想获得可靠的分析结果，良好的分离效果依然是十分重要的(Chen et al. 2013)。每种分离方法均有其优缺点。例如，气相色谱仪具有较好的选择性和灵敏度(Novakova et al. 2014)，但是由于运行温度往往处在较高的水平(一般为 90 ℃-300 ℃)，而且运行的时间较长。有研究采用气相色谱分析 5 种除草剂，仪器分析时间为 27 min (Mayer et al. 2009)。液相色谱也具有一些缺点，例如，液相色谱一般需要较大体积的有机溶剂或化学试剂作为流动相。因此，采用更加简便、省时及绿色环保的分析方法依然是烟草除草剂超灵敏检测的研究应用方向。
图 5-1 展示了 6 种目标物质的分子结构式，其中大多数具有相似的酰胺类结构和相近的官能团。本章将重点研究及优化 UPC2参数对 6 种目标物质的影响，并对前处理过程进行研究。从而实现对烟草中 6 种除草剂的 UPC2同时分析。
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第六章 结论、创新点与展望
烟草中农药残留问题已经越来越受到消费者和相关的管理部门及生产企业的重视。本文的目的是研究更加快速、高效、高通量，具有较高灵敏度及选择性，分析过程更加稳定，分析结果可靠的检测方法，并将其应用在烟草农残的实际检测当中。内容主要包括以下三个方面：首先，研发了以铵盐作为盐析试剂的烟叶样品预处理技术，采用分析物保护剂进行 GC-MS/MS 分析，建立了烟草中农药多残留的分析方法，提高了常规 GC-MS/MS 法对烟叶中农药多残留分析结果的检测可靠性；其次，建立了烟叶中农药多残留分析的在线 GPC-GC-MS/MS 分析方法，探索了样品提取试剂、净化模式等样品前处理模式对检测结果的影响，对 GPC 的基本参数进行了优化，最终获得了较好的分析效果；最后，研究了烟草中除草剂及拟除虫菊酯类农药的 UPC2多农残检测方法，对 6 种除草剂及 2 种拟除虫菊酯的 UPC2参数、提取剂净化过程进行优化，实现了各种目标物质的高效分离检测。以下为本研究的主要结论、创新点。同时，对相关研究的发展趋势进行展望。
6.1.1 烟叶铵盐盐析预处理技术及分析物保护剂在GC-MS/MS农药残留分析中的应用
研发以铵盐作为盐析试剂的烟叶样品预处理技术，并采用分析物保护剂进行GC-MS/MS 分析，获得以下结果：(1)通过改变前处理过程中的盐析试剂，利用熔点和沸点均低于质谱运行温度的甲酸铵作为盐析试剂，有效减少残留盐份在离子源表面形成沉淀的问题，延长了离子源维护后的正常运行时间；(2)通过采用分析物保护剂(3-氧乙基 1, 2 丙二醇、古洛糖酸内酯、D-山梨醇以及莽草酸等)与烟叶基质共同配标，有效保证了分析目标物在仪器分析过程中的响应值，分析结果更加可靠。经过研究，本方法能够对烟叶中 150 种农药残留成分进行检验，所分析的大部分农残目标物回收率在70%-120%范围，日内精密度及日间精密度理想。
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参考文献（略）
本文编号：128485
本文链接：https://www.wllwen.com/wenshubaike/shuzhibaogao/128485.html
