过量表达拟南芥CAT影响烟草对气体甲醛吸收的机理研究

发布时间：2017-06-11 18:10

  本文关键词：过量表达拟南芥CAT影响烟草对气体甲醛吸收的机理研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：现代工业将大量甲醛使用在装修材料中,使甲醛成为我国室内空气污染的首要污染物。在众多的甲醛治理方法中,植物净化法以其环保、经济、便捷等优点受到人们的关注和青睐。普通的观赏植物由于它们的气体甲醛吸收能力普遍较低,所以清除甲醛的效果都不太理想。有研究表明植物受气体甲醛胁迫时体内会积累大量的H202,而H202诱发一系列的信号转导来促进气孔的关闭,从而降低植物对气体甲醛的吸收效率。本研究试图在野生型烟草叶绿体中过量表达拟南芥CAT(过氧化氢酶),提高转基因烟草的抗氧化酶活性,使其受气体甲醛胁迫时能及时有效的清除体内积累的H202,从而使气孔保持较大的开度和导度,提高甲醛吸收效率,为利用基因工程手段提高植物甲醛修复污染能力提供新的操作策略和理论依据,取得的主要研究结果如下：1.为使CAT表达后能定位到叶绿体中,利用Gateway技术构建了一个由光诱导型启动子(Prbcs)驱动CAT表达的植物表达载体pK2-PrbcS-*T-CAT,通过该载体表达的CAT蛋白可通过Prbcs下游叶绿体基质定位信号肽(*T)引导到植物叶绿体中。利用pK2-PrbcS-*T-CAT转化野生型烟草(WT)获得卡那霉素(Km)抗性的转基因株系5个,基因组PCR分析确认5个Km抗性株系中均有CAT基因插入,RT-PCR分析证实5个转基因株系中均有CAT基因的表达,测定CAT活性选出CAT活性较高的转基因烟草株系C1和C3。2.分析高浓度气体甲醛胁迫对WT和C1、C3转基因烟草生理特性的影响,结果说明10-20ppm气体甲醛胁迫短时间后,C1、C3转基因烟草气孔导度和开度高于WT,而氧化胁迫相关指标H202、丙二醛(MDA)、羰基化蛋白(PC)含量低于WT。H202荧光探针分析证实在10 ppm气体甲醛下C1、C3叶片下表皮中积累H202的保卫细胞数显著少于WT。C1、C3转基因烟草对10-20ppm气体甲醛吸收效率也高于WT。保卫细胞中含有叶绿体,叶绿体是保卫细胞中H2O2的最大来源,过量表达CAT可能通过降低气体甲醛胁迫下Cl、C3保卫细胞中H202的积累而增加叶片的气孔导度和开度,从而增加它们的气体甲醛吸收效率。免疫共沉淀分析表明,在10-20ppm气体甲醛胁迫下,C1、C3转基因烟草叶片中14-3-3蛋白和质膜H+-ATPase的互作水平高于WT；它们的质膜H+-ATPase活性和氢泵活性也高于WT。说明过量表达CAT的C1、C3烟草叶片能及时清除气体甲醛胁迫积累的H202,从而能降低H202引起的气孔关闭的信号转导作用,使促进14-3-3蛋白和质膜H+-ATPase的结合,进而增强质膜H+-ATPase活性和氢泵活性,使气孔开度和导度增加。3.利用家具中的污染的低浓度气体甲醛处理WT和C1、C3转基因烟草,考转基因和WT烟草甲醛污染环境中长时间(72 h)放置后对甲醛胁迫的应答效果,结果和高浓度处理的相似,转基因烟草气孔导度和开度高于WT; H2O2、 MDA、PC氧化损伤指标较低,C1、C3叶片中积累H2O2的保卫细胞数少于WT烟草。免疫共沉淀和Western分析表明,气体甲醛胁迫72 h后转基因烟草14-3-3蛋白和质膜H+-ATPase的互作水平高于WT；质膜H+-ATPase活性和氢泵活性也高于WT。这些结果说明减少气体甲醛胁迫下叶片中H202的积累,增加14-3-3蛋白和质膜H+-ATPase的互作使质膜H+-ATPase活性和氢泵活性提高是过量表达的CAT增强转基因烟草在气体甲醛胁迫的气孔运动和甲醛吸收的重要机制。
【关键词】：过氧化氢酶 气体甲醛胁迫 气孔运动 质膜H~+-ATPase 甲醛吸收
【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：X51;Q945
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-18
• 缩略词18-19
• 第一章 绪论19-42
• 1.1 甲醛污染现状及其危害19-20
• 1.1.1 甲醛的性质19
• 1.1.2 甲醛的污染来源及现状19-20
• 1.1.3 甲醛对人体的危害20
• 1.2 甲醛污染的治理方法20-22
• 1.2.1 物理方法和化学方法20-21
• 1.2.2 生物清除法21-22
• 1.3 植物HCHO吸收能力和吸收机理的研究进展22-29
• 1.3.1 植物HCHO吸收能力的研究进展22-23
• 1.3.2 植物吸收气体HCHO机理的研究进展23-29
• 1.3.2.1 调控植物气孔开放的相关因素23-28
• 1.3.2.2 植物HCHO吸收的代谢途径的研究28-29
• 1.4 提高植物HCHO代谢能力和抗性的遗传工程研究进展29-32
• 1.4.1 过量表达FDH/SHMT提高转基因烟草吸收HCHO能力的遗传操作29-30
• 1.4.2 转入甲醛光合同化途径提高转基因植物吸收HCHO能力的遗传工程30-32
• 1.4.3 甲醛脱氢酶(FALDH)和其他基因的转入提高植物甲醛修复能力的遗传工程32
• 1.5 植物响应HCHO胁迫生理机理和分子机理的研究进展32-36
• 1.5.1 HCHO胁迫对植物生理生化特性的影响32-33
• 1.5.2 植物响应HCHO胁迫应答基因的研究进展33-36
• 1.5.2.1 代谢和能量相关基因33-34
• 1.5.2.2 光合相关基因34-35
• 1.5.2.3 防御相关基因35-36
• 1.6 过氧化氢和过氧化氢酶概述36-40
• 1.6.1 过氧化氢简介36-37
• 1.6.2 过氧化氢酶的结构特征37
• 1.6.3 过氧化氢酶的生理功能37-39
• 1.6.3.1 植物的抗逆信号分子37-38
• 1.6.3.2 增强植物的光合能力及延缓衰老38
• 1.6.3.3 维持植物细胞内的氧化还原平衡38-39
• 1.6.4 过氧化氢酶基因的克隆和转基因植物的抗逆性39-40
• 1.7 本研究的目的和意义40-42
• 第二章 过量表达拟南芥CAT植物表达载体的构建与转基因植物的鉴定42-53
• 2.1 材料与方法42-49
• 2.1.1 植物材料培养43
• 2.1.2 菌株及相关载体与材料43
• 2.1.3 CAT入门克隆载体pENTR~*-PrbcS-~*T-CAT和植物过表达载体pK_2-PrbcS-~*T-CAT的构建43-46
• 2.1.4 烟草的遗传转化及转基因烟草的培养与筛选46-47
• 2.1.5 过表达CAT转基因烟草基因组插入和转录水平的检测47-48
• 2.1.6 过表达CAT转基因烟草CAT活性的检测48
• 2.1.7 大量培养无菌转基因烟草幼苗48-49
• 2.1.8 数据统计分析49
• 2.2 结果与分析49-51
• 2.2.1 植物过表达载体pK_2-PrbcS-~*T-CAT的构建49-50
• 2.2.2 过表达CAT转基因烟草的鉴定50-51
• 2.3 讨论51-53
• 第三章 过量表达拟南芥CAT增强烟草对气体甲醛吸收和生理抗性53-69
• 3.1 材料与方法54-58
• 3.1.1 植物材料培养54
• 3.1.2 转基因烟草对气体甲醛吸收能力的测定54-55
• 3.1.3 气体甲醛胁迫下野生型和转基因烟草气孔导度、蒸腾速率的测定55
• 3.1.4 气体甲醛胁迫下野生型和转基因烟草气孔开度的观察55
• 3.1.5 叶绿素含量的测定55
• 3.1.6 可溶性糖和总蛋白含量的测定55-56
• 3.1.7 H_2O_2荧光标记染色56-57
• 3.1.8 H_2O_2、MDA和PC含量的测定57-58
• 3.1.9 数据统计分析58
• 3.2 结果与分析58-66
• 3.2.1 过量表达拟南芥CAT的转基因烟草植株吸收气体甲醛能力58-60
• 3.2.2 气体甲醛胁迫下野生型和转基因烟草气孔导度、开度及蒸腾速率的比较60-62
• 3.2.4 气体甲醛胁迫下野生型和转基因烟草叶绿素含量的变化62-63
• 3.2.5 气体甲醛胁迫下野生型和转基因烟草可溶性总糖和总蛋白含量的变化63-64
• 3.2.6 H_2O_2探针检测气体HCHO胁迫处理烟草叶片中的H_2O_264-65
• 3.2.7 气体甲醛胁迫下野生型和转基因烟草叶片H_2O_2、MDA和PC含量的变化65-66
• 3.3 讨论66-69
• 第四章 过量表达拟南芥CAT增强烟草对气体甲醛吸收的分子机理研究69-76
• 4.1 材料与方法69-71
• 4.1.1 胁迫处理的烟草叶片质膜提取和PM H~+-ATP酶活性测定69-70
• 4.1.2 胁迫处理的烟草叶片氢泵活性测定70
• 4.1.3 14-3-3蛋白抗体、向光素抗体及质膜H~+-ATPase抗体的制备70
• 4.1.4 免疫共沉淀检测14-3-3蛋白与质膜H~+-ATP酶和向光素的互作70-71
• 4.1.5 数据统计分析71
• 4.2 结果与分析71-74
• 4.2.1 气体甲醛胁迫对烟草叶片14-3-3蛋白与向光素、质膜H~+-ATPase互作的影响71-72
• 4.2.2 气体甲醛胁迫对烟草叶片质膜H~+-ATPase活性的影响72-73
• 4.2.3 气体甲醛胁迫对烟草叶片氢泵活性的影响73-74
• 4.3 讨论74-76
• 第五章 过量表达拟南芥CAT增强烟草对环境污染气体甲醛吸收的机理研究76-88
• 5.1 材料与方法76-78
• 5.1.1 植物材料培养76-77
• 5.1.2 气体甲醛胁迫处理的方法77
• 5.1.3 气体甲醛胁迫下野生型和转基因烟草气孔导度、开度及蒸腾速率的测定77
• 5.1.4 叶绿素含量的测定77
• 51.5 可溶性糖和总蛋白含量的测定77
• 5.1.6 H_2O_2探针检测胁迫处理烟草叶片中的H_2O_277
• 5.1.7 H_2O_2、MDA和PC含量的测定77
• 5.1.8 胁迫处理的烟草叶片质膜提取和PM H~+-ATP酶活性测定77
• 5.1.9 胁迫处理的烟草叶片氢泵活性的测定77-78
• 5.1.10 14-3-3 蛋白抗体、向光素抗体及质膜H~+-ATPase抗体的制备78
• 5.1.11 免疫共沉淀检测14-3-3蛋白与向光素、质膜H~+-ATPase的互作78
• 5.1.12 数据统计分析78
• 5.2 结果与分析78-86
• 5.2.1 气体甲醛胁迫下野生型和转基因烟草气孔导度、开度及蒸腾速率的比较78-81
• 5.2.2 气体甲醛胁迫下野生型和转基因烟草叶绿素含量的变化81-82
• 5.2.3 气体甲醛胁迫下野生型和转基因烟草可溶性总糖和总蛋白含量的变化82-83
• 5.2.4 H_2O_2探针检测胁迫处理烟草叶片中的H_2O_283-84
• 5.2.5 气体甲醛胁迫下野生型和转基因烟草叶片MDA、H_2O_2和PC含量的变化84-85
• 5.2.6 气体甲醛胁迫对烟草叶片14-3-3蛋白与向光素、PMH~+-ATPase的互作水平,以及对PM H~+-ATPase活性、氢泵活性的影响85-86
• 5.3 讨论86-88
• 第六章 总结与展望88-90
• 6.1 总结88-89
• 6.2 展望89-90
• 致谢90-91
• 参考文献91-105
• 附件A105

【参考文献】

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