呼吸道合胞病毒抑制剂筛选及环匹阿尼酸抗病毒机制研究

发布时间：2017-10-12 23:27

  本文关键词：呼吸道合胞病毒抑制剂筛选及环匹阿尼酸抗病毒机制研究

  更多相关文章： 呼吸道合胞病毒 高通量筛选 天然产物 环匹阿尼酸 细胞质钙离子浓度

【摘要】：呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是一种常见的引起婴幼儿急性下呼吸道感染的病原,RSV同时可以感染免疫缺陷人群,器官移植后的病人和老年人,引起高致死率。RSV于1956年在一只黑猩猩鼻炎分泌物中首次发现,第二年有报道显示RSV可以感染婴幼儿导致支气管炎。RSV属于副粘病毒科,是一种单链负链RNA病毒。基因组15.2 kb,编码11种蛋白。它分为A,B两个亚型,每年交替流行出现。每年感染约3千万儿童,其中发展中国家受影响最大。在世界范围内,还没有疫苗或有效的抗病毒治疗方法。所以亟待研发有效的抗病毒药物和疫苗。早期研制的甲醛灭活疫苗不但不能提供足够的保护,而且出现了免疫增强引起的疾病,甚至导致了婴儿死亡。目前唯一获得批准的治疗药物是利巴韦林(ribavirin),但是由于它存在有效性有待确定,毒性较大等原因仅被用于高危患儿。虽然一种人单克隆抗体帕丽珠单抗(Palivizumab)已经获得批准,由于费用昂贵等问题难以广泛应用。为了寻找新的抑制RSV的小分子化合物,我们建立了一种基于检测病毒引起细胞病变(Cytopathic Effect,CPE)的高通量筛选方法。我们的筛选方法是基于呼吸道合胞病毒感染细胞后会引起细胞融合形成大量合胞体导致细胞死亡,加入抑制剂将会有效抑制这一过程的原理。在感染前加入化合物,与病毒共培养4天后通过荧光试剂检测化合物抑制细胞病变效果。该方法可靠高效,可以筛选到抑制病毒生活史各时期的化合物。经过优化筛选条件,我们最终确定了筛选条件,在96孔板中每孔铺入5000个HEp-2细胞,培养24 h后加入稀释到终浓度为2.5μg/ml的化合物,加入药物混匀后10分钟加入感染复数MOI=0.5的病毒溶液,培养96 h后通过测细胞活性的方式检测化合物抑制病毒效果。通过筛选含有502个天然化合物的药物库,我们找到7个抑制率大于40%的天然化合物,用于进一步验证。其中环匹阿尼酸(Cyclopiazonic acid,CPA)效果最佳,我们深入研究了它的抗病毒机制。环匹阿尼酸是一种特异性的内质网钙泵抑制剂,在低毒性浓度强烈抑制RSV复制。我们测得EC50为4.2μM,CC50为33.9μM,SI 8.2。通过细胞病变检测和病毒产量减少实验两种体外实验验证了环匹阿尼酸(CPA)对呼吸道合胞病毒(RSV)的抑制效果。CPA抑制RSV A和B病毒株复制,同时它抑制人类副流感病毒(PIV-3),但并不抑制肠病毒71型(EVA-71)。通过定点加药实验研究CPA的作用机理,发现CPA在感染0-8 h抑制病毒复制或转录过程。通过小基因组检测(minigenome assay)实验验证了CPA在病毒基因组复制的过程中起作用。另外合胞形成实验显示CPA抑制RSV合胞形成。我们进一步研究了它的抗病毒机制,我们检测了另外两个钙ATP酶抑制剂(Thapsigargin,TG和BHQ)对于病毒复制的作用,我们发现这两种细胞内钙泵抑制剂抑制病毒复制,其中10 nm TG可以使病毒效价降低124.5倍。我们推测由于钙泵引起细胞溶质内钙离子浓度升高抑制了病毒复制过程。进而我们研究了两种钙离子载体(A23187,Ionomycin)以及一种Na+/K+-ATP酶均表现出病毒复制抑制作用。而通过抑制细胞膜表面的钙离子通降低细胞内钙离子浓度(Nifedipine、Nimodipine和Tetrandrine)并不能抑制病毒复制。因此,我们的研究结果表明细胞内钙浓度的增加对于RSV复制有抑制效果,提示一种新的RSV治疗。
【关键词】：呼吸道合胞病毒 高通量筛选 天然产物 环匹阿尼酸 细胞质钙离子浓度
【学位授予单位】：上海大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R373.14
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 第一章 绪论13-24
• 1.1 呼吸道合胞病毒的生物学特性13-15
• 1.1.1 呼吸道合胞病毒形态多样性13
• 1.1.2 呼吸道合胞病毒基因结构和蛋白功能13-15
• 1.1.3 呼吸道合胞病毒受体15
• 1.2 呼吸道合胞病毒流行病学特征15-16
• 1.3 呼吸道合胞病毒免疫反应及发病机制16-18
• 1.4 抗病毒机制研究及药物、疫苗研究进展18-21
• 1.4.1 抗病毒药物研究进展18-19
• 1.4.2 其他抗病毒机制研究19-20
• 1.4.3 抗呼吸道合胞病毒疫苗20-21
• 1.5 课题研究的目的和意义21-22
• 1.6 国内外研究概况22-24
• 1.6.1 国内研究状况22-23
• 1.6.2 国外研究状况23-24
• 第二章 实验材料与方法24-35
• 2.1 实验材料24-27
• 2.1.1 细胞系及病毒株24
• 2.1.2 化合物24-25
• 2.1.3 溶液25
• 2.1.4 试剂耗材25-27
• 2.1.5 实验仪器27
• 2.2 实验方法27-35
• 2.2.1 细胞及病毒培养27-28
• 2.2.2 高通量筛选条件的确定28-29
• 2.2.3 高通量药物筛选29
• 2.2.4 剂量依赖细胞病变验证实验29-30
• 2.2.5 细胞毒性实验30
• 2.2.6 空斑实验测定病毒滴度30-31
• 2.2.7 呼吸道合胞病毒生长曲线测定31-32
• 2.2.8 病毒产量减少实验32
• 2.2.9 定点加药实验32
• 2.2.10 小基因组检测32-33
• 2.2.11 合胞形成实验33
• 2.2.12 数据处理33-35
• 第三章 实验结果35-50
• 3.1 基于细胞病变检测的高通量药物筛选35-39
• 3.1.1 筛选条件优化35-37
• 3.1.2 筛选条件的验证37
• 3.1.3 天然化合物库筛选37-38
• 3.1.4 初筛化合物验证38-39
• 3.2 环匹阿尼酸抗病毒作用39-43
• 3.2.1 环匹阿尼酸对于呼吸道合胞病毒抑制作用39-42
• 3.2.2 环匹阿尼酸对于副流感病毒及肠道病毒作用42-43
• 3.3 环匹阿尼酸抗病毒机制研究43-50
• 3.3.1 环匹阿尼酸抑制呼吸道合胞病毒复制或转录过程43-44
• 3.3.2 环匹阿尼酸抑制呼吸道合胞病毒复制作并不是由于抑制内质网钙泵引起44-46
• 3.3.3 提高细胞质内Ca~(2+)浓度抑制呼吸道合胞病毒复制46
• 3.3.4 抑制细胞膜离子通道并不能抑制病毒复制46-48
• 3.3.5 增强内质网钙泵活力能缓解对呼吸道合胞病毒抑制48-50
• 第四章 讨论与展望50-53
• 参考文献53-59
• 发表文章及专利59-60
• 致谢60-61

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 程晔;呼吸道合胞病毒研究有新发现[J];医学信息;1997年09期

2 ;呼吸道合胞病毒的分离及其生物性状的研究[J];微生物学报;1975年02期

3 洪陶;;呼吸道合胞病毒株在流行周期中发生变异的一些规律[J];国外医学(微生物学分册);1983年06期

4 张伊璜;;小鼠呼吸道合胞病毒的感染[J];国外医学(微生物学分册);1984年04期

5 胡伯渊,纪耀沅;婴儿肺炎呼吸道合胞病毒的分离鉴定[J];江苏医药;1982年05期

6 杨佩珍;;老年监护病房中的一次呼吸道合胞病毒暴发流行[J];国外医学(老年医学分册);1986年04期

7 闵静娟;王之梁;;呼吸道合胞病毒研究进展[J];国外医学(微生物学分册);1987年05期

8 段佩若,张力力,韩洪彦;呼吸道合胞病毒单克隆抗体用于纸上桥联酶标诊断的初步探讨[J];细胞与分子免疫学杂志;1990年03期

9 段佩若,张励力,韩洪彦,常汝虚,谢建平,周天栋,李冬,于国慧,徐文华;呼吸道合胞病毒单克隆抗体用于纸上桥联酶标诊断的初步探讨[J];细胞与分子免疫学杂志;1991年01期

10 许国英;赵惠芬;龚明敏;阎田玉;;活血化瘀为主治疗呼吸道合胞病毒肺炎[J];中医杂志;1991年09期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 赵晓东;;呼吸道合胞病毒单抗逃逸株适合度评价[A];中华医学会第十四次全国儿科学术会议论文汇编[C];2006年

2 吴苔;孙伟;汪洁;陈理华;;新生儿呼吸道合胞病毒肺炎48例临床分析[A];2007年浙江省儿科学、小儿外科学学术年会论文汇编[C];2007年

3 丁国标;;住院患儿急性下呼吸道感染病原学调查[A];中华医学会第十三届全国儿科呼吸学术会议论文汇编[C];2012年

4 赵惠芬;李莉;韩瑞珠;;567例呼吸道合胞病毒肺炎的临床研究[A];全国中西医结合儿科第十次学术会议论文集[C];2002年

5 郑晓群;陈小芳;林虹;张信良;吕建新;;实时逆转录聚合酶链反应快速鉴别呼吸道合胞病毒亚型[A];浙江省生物化学与分子生物学学术交流会论文集[C];2005年

6 赵晓东;;肝素阻断呼吸道合胞病毒与气道上皮细胞黏附[A];中华医学会第十四次全国儿科学术会议论文汇编[C];2006年

7 刘玉华;侯安存;赵高潮;王凤莲;乌珊娜;;中西药联合应用对呼吸道合胞病毒抑制作用的研究[A];第五次全国中西医结合中青年学术研讨会论文汇编[C];2004年

8 林新;王建平;熊广;余然;高雪;曲敬来;;呼吸道合胞病毒与成人支气管哮喘急性发作的相关性研究[A];2006年全国危重病急救医学学术会议论文集[C];2006年

9 梁园;陈尚勤;;新生儿呼吸道合胞病毒肺炎的临床特点[A];2011年浙江省医学会儿科学分会学术年会暨儿内科疾病诊治新进展国家级学习班论文汇编[C];2011年

10 钱月芳;高兰平;汤华平;顾晓玲;马泽南;莫建青;;呼吸道合胞病毒与婴幼儿早期喘息的相关分析[A];2012年江浙沪儿科学术年会暨浙江省医学会儿科学分会学术年会、儿内科疾病诊治新进展国家级学习班论文汇编[C];2012年

中国重要报纸全文数据库 前7条

1 编译 李勇;呼吸道合胞病毒新药研发求破局[N];中国医药报;2012年

2 邵建国;帕利珠单抗打响保卫战[N];医药经济报;2010年

3 言凤鸣;呼吸道合胞病毒易引发儿童感冒和肺炎[N];卫生与生活报;2008年

4 伊遥;抗呼吸道合胞病毒感染“真空”待补[N];医药经济报;2012年

5 张见麟;小心呼吸道合胞病毒随冷空气而至[N];健康报;2003年

6 记者 李晓;4年追踪揪出儿童感冒“元凶”[N];苏州日报;2010年

7 ;几种呼吸道病毒性疾病表现[N];中国医药报;2006年

中国博士学位论文全文数据库 前5条

1 谷宏婧;呼吸道合胞病毒的病毒样颗粒疫苗制备及其感染导致肺损伤机制研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2015年

2 冯凯;流感病毒与呼吸道合胞病毒双重感染BALB/c小鼠的研究[D];北京协和医学院;2015年

3 郑林玲;量子点标记的呼吸道合胞病毒活细胞内动态输运途径示踪分析[D];西南大学;2014年

4 刘晓鸣;呼吸道合胞病毒致大鼠肾病多种损伤机制研究[D];四川大学;2006年

5 蒋雄斌;CD8～+T细胞在呼吸道合胞病毒诱导的哮喘中的作用研究[D];南京医科大学;2006年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 金婷婷;Chemerin在婴幼儿呼吸道合胞病毒肺炎中的意义[D];复旦大学;2013年

2 刘沁;呼吸道合胞病毒载量与急性下呼吸道感染病情严重程度的相关性[D];南华大学;2015年

3 刘太香;呼吸道合胞病毒感染调控NLRC5表达及其意义[D];南京大学;2014年

4 沈黎;金蝉口服液治疗小儿呼吸道合胞病毒（RSV）肺炎的有效性与安全性临床研究[D];苏州大学;2016年

5 崔睿;呼吸道合胞病毒抑制剂筛选及环匹阿尼酸抗病毒机制研究[D];上海大学;2016年

6 丰达星;河南省呼吸道合胞病毒分子生物学研究[D];郑州大学;2008年

7 熊鹰;武汉地区儿童感染呼吸道合胞病毒的分子流行病学研究[D];华中师范大学;2011年

8 秦弦;重庆地区呼吸道合胞病毒F和G基因变异分析（2009年-2011年）[D];重庆医科大学;2012年

9 王瑞博;呼吸道合胞病毒重组融合蛋白TB10.4-F1免疫原性和安全性的研究[D];昆明理工大学;2011年

10 夏秋玲;呼吸道合胞病毒分离培养及其F蛋白基因变异分析[D];重庆医科大学;2013年

，

本文编号：1021540