GRP78重组表达腺病毒的构建及在HepG2细胞的表达及其相关功能研究
本文关键词:GRP78重组表达腺病毒的构建及在HepG2细胞的表达及其相关功能研究
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【摘要】:目的:构建葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)重组表达腺病毒pAd-GRP78,并感染HepG2细胞建立能够高表达GRP78的细胞模型,同时在HepG2细胞中研究重组表达GRP78腺病毒对细胞增殖能力的影响。方法:利用腺病毒穿梭质粒pAd Track-TO4构建载有GRP78基因的穿梭质粒pAd Track-TO4-GRP78载体,并通过基因测序鉴定载体序列正确。将载体用PmeⅠ酶切线性化,与Ad Easy-BJ5183感受态细胞进行基因同源重组。将重组后的腺病毒载体经PacⅠ酶切线性化后,转染到HEK293细胞中进行包裹,根据增强绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein,EGFP)的表达判断重组腺病毒的包装情况。通过反复离心和低温裂解细胞提取GRP78重组表达腺病毒。以人肝癌HepG2细胞为目标,进行病毒感染。通过qRT-PCR检测GRP78基因表达情况,使用Western blot检测GRP78蛋白的表达。最后感染HepG2细胞,通过MTS比色法检测重组表达GRP78腺病毒对细胞增殖的影响。结果:测序验证pAd Track-TO4-GRP78构建成功,酶切验证重组腺病毒载体pAd-GRP78构建成功。在HEK293细胞中将pAd-GRP78包裹,GPF荧光检测结果表示病毒包装成功。使用pAd-GRP78感染人肝癌HepG2细胞,qRT-PCR检测到细胞中GRP78基因的过表达,Western blot方法检测到GRP78蛋白的高表达。MTS检测结果显示重组表达GRP78腺病毒对HepG2肝癌细胞有促增殖作用。结论:实验成功构建了GRP78重组表达腺病毒,并验证了构建的腺病毒载体可以收集并感染HepG2细胞表达GRP78蛋白。证明了重组表达GRP78腺病毒能够促进肝癌细胞的增殖。为进一步研究GRP78的功能奠定了基础。
【作者单位】: 重庆医科大学检验医学院;感染性疾病分子生物学教育部重点实验室;重庆市渝北区人民医院医学检验科;
【关键词】: 腺病毒 葡萄糖调节蛋白 HepG细胞 MTS
【基金】:国家自然科学基金资助项目(编号:81301395)
【分类号】:R373;Q78
【正文快照】: 葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein78,GRP78),是热休克蛋白70(heat shock proteins,HSPs)家族的成员之一。GRP78作为定位于内质网的结合蛋白,有分子伴侣、维持内质网的稳定,保护细胞等多种功能。近年来研究发现GRP78在细胞应激时大量表达,降低细胞凋亡,对于慢性心功
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,本文编号:1096091
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