hTERT（人端粒酶逆转录酶基因）转染雪旺细胞后对其影响的实验研究

发布时间：2017-12-27 09:26

本文关键词：hTERT（人端粒酶逆转录酶基因）转染雪旺细胞后对其影响的实验研究　出处：《大连医科大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:1.采用7天左右的新生SD大鼠的雪旺细胞用脂质体转染的方法进行hTERT的转染，体外分离培养，探索安全、高效的脂质体转染方法期望获得永生化的雪旺细胞。 2.对转染后的雪旺细胞和未转染的雪旺细胞在细胞的增殖周期、形态、分泌功能方面的变化进行对比检测，通过具体的实验证明细胞永生化以后的优势和缺点，对永生化的雪旺细胞应用于神经组织工程奠定基础。方法:1.选取出生后7天左右的SD大鼠，冰冻处死后碘伏浸泡消毒，取其坐骨神经以及臂丛神经，剪碎至1mm3大小的组织块，双酶消化法进行体外分离培养，待细胞生长到85%汇合密度时用低浓度胰酶快速消化传代，30分钟差速贴壁法进一步纯化雪旺细胞，，用光学显微镜进行形态学观察并拍照，S-100蛋白免疫荧光鉴定拍照。 2.将纯化的雪旺细胞用含hTERT基因的质粒经脂质体转染法转染雪旺细胞，用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养细胞，待细胞生长满80%密度时更换含G418（100ug/ml）的完全培养基，每3天换液1次，筛选2周，转入含hTERT基因的质粒的细胞经过筛选获得阳性克隆后继续传代培养，传代后的细胞一部分用于S-100蛋白免疫荧光鉴定，流式细胞仪检测转染后雪旺细胞以及未转染细胞对照组的细胞周期，免疫印迹Western blot法分别检测转染雪旺细胞的的5、10、15、20代以及对照组未转染雪旺细胞神经营养因子（NGF）的分泌。结果:1.经双酶消化法可以获得大量增殖的雪旺细胞，差速贴壁传代后可以获得典型的长梭形放射状肩并肩排列的雪旺细胞，光镜视野下雪旺细胞纯度可以达到90%以上，成纤维细胞量少，经S-100蛋白免疫荧光测定鉴定为雪旺细胞 2.脂质体转染法转染hTERT后光学显微镜观察可见转染后的雪旺细胞胞体体积大，长梭形。无规则贴壁生长，胞质黄色，经S-100免疫荧光鉴定为雪旺细胞 3.流式细胞仪检测转染后的雪旺细胞周期发现S期细胞为42.76%，未转染雪旺细胞S期为13.99%。 4.经western blot检测未转染雪旺细胞和转染雪旺细胞（5、10、15、20代）NGF的分泌，结果显示NGF分泌量对比转染前雪旺细胞NGF分泌量是增加的。结论:1.使用7天左右的SD乳鼠取坐骨神经及其臂丛神经，采用双酶消化，组织块接种，差速贴壁法传代可以获得纯度90%以上的雪旺细胞。 2.经脂质体转染法hTERT转染雪旺细胞可以获得纯的雪旺细胞并且比未转染的雪旺细胞分裂增殖增强，NGF分泌量增加。
[Abstract]:Objective: 1.. HTERT transfection was carried out by liposome transfection of 7 day old newborn SD rats, and cultured in vitro. A safe and effective liposome transfection method was explored to obtain immortalized Schwann cells.
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R329

【参考文献】