重组人巨细胞病毒基因在大肠杆菌中的表达

发布时间：2017-12-28 07:23

本文关键词：重组人巨细胞病毒基因在大肠杆菌中的表达　出处：《大连理工大学》2011年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：随着蛋白质结构与功能研究的日益发展,获得大量纯化的可溶性目的蛋白质成为这一研究的基础,在原核系统内表达外源基因是获得大量目的蛋白质最简单、最经济的方法,但是由于原核系统自身不存在翻译后修饰等特性,使得表达的目的蛋白质常常形成无生物活性的包涵体。因此,尝试利用不同的原核表达体系获得可溶性并且结构稳定的目的蛋白质成为在原核系统表达蛋白质所要解决的首要问题。本文通过重叠延伸PCR方法获得人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus, HCMV)被膜磷蛋白pp65362-504与包膜糖蛋白gB607-621融合基因,分别构建原核表达载体pET21b(+)、pTYB11、pPAL7、pCW-ori、pMAL-c2X并在大肠杆菌中进行表达。重组目的基因的pET21b (+)、pTYB11、pPAL7原核表达载体,经过IPTG诱导表达,目的蛋白质以包涵体形式存在,通过改变诱导温度及IPTG浓度,目的蛋白质依然以不可溶的包涵体形式存在。重组目的基因的pCW-ori原核表达载体,通过IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳验证,蛋白质以可溶形式存在,gB蛋白单克隆抗体Western Blot证实目的蛋白得到表达,说明目的蛋白质以可溶性形式存在；通过Ni-柱亲和层析、SepharoseQ-FF阴离子交换层析和Superdex 75凝胶过滤层析对目的蛋白质进行分离纯化,得到单一条带蛋白质,采用质谱对分离得到的目的蛋白质进行精密分子量分析,结果显示,分离得到的单一蛋白质产物,大小为12.856KDa和14.4KDa,与目的蛋白质预期分子量大小存在差距。重组目的基因的pMAL-c2X表达载体,经IPTG诱导表达,融合蛋白质存在于可溶性上清中,经Amylose柱一步纯化,纯化产物经Factor Xa蛋白酶切割,目的蛋白消失。研究表明,原核细胞内实现重组人巨细胞病毒pp65362-504-gB607-621可溶性表达并且获得结构稳定的蛋白的目标尚难实现。实现pp65362-504-gB607-621融合基因可溶性表达并且获得结构稳定的蛋白质仍需进一步探索,为了获得结构稳定并且可溶的目的蛋白质,可以考虑将目的蛋白质分泌到周质空间或胞外进行目的蛋白质分泌表达。
[Abstract]:With the increasing development of the study of protein structure and function, to obtain a large number of purified soluble protein became the basis of the study, the prokaryotic expression of exogenous gene is the method to obtain the amount of target protein in the easiest and most economical, but because the prokaryotic system itself does not exist modification after translation characteristics, the purpose of protein expression often the formation of inclusion bodies with no biological activity. Therefore, trying to use different prokaryotic expression system to get soluble and stable target protein is the primary problem to solve in prokaryotic system.
【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R378

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