琥珀酰辅酶A转移酶硝基化酪氨酸位点特异单克隆抗体的制备
本文关键词：琥珀酰辅酶A转移酶硝基化酪氨酸位点特异单克隆抗体的制备 出处：《湖南农业大学》2011年硕士论文 论文类型：学位论文
【摘要】：硝基化是氧化应激条件下由活性氮物质引起的主要蛋白质翻译后修饰之一,其中一种主要产物是3-硝基化酪氨酸(3NT)。肝外组织线粒体琥珀酰辅酶A转移酶(SCOT)是一种重要的酮体代谢限速酶,通过LC-ESI-MS/MS分析,体外重组SCOT中的4位、76位酪氨酸残基(Tyr4、Tyr76)被认为是过氧亚硝酸(ONOO-)的首要攻击位点并且生成3NT。虽然SCOT酪氨酸硝基化修饰导致的蛋白质活性降低在糖尿病中已经被证实,但是由于SCOT蛋白质丰度以及离子化技术限制其体内硝基化位点无法通过质谱技术准确检测,而开发特异性抗体则有可能方便将其检测出来。 为了检测糖尿病小鼠模型SCOT中酪氨酸硝基化位点,本实验中,我们通过人工合成包含了硝基化Tyr4和Ty；76的肽段偶联KLH作为抗原制备单克隆抗体,免疫Balb/c小鼠。脾细胞通过传统PEG法与骨髓瘤细胞SP2/0融合制备杂交瘤细胞。通过克隆化,ELISA分步筛选过程,获得和制备了4株单克隆抗体(CN-10、CN-11、CE-9、CE-14),能分别特异性结合各自硝基化抗原。分析表明四株抗体均是IgG1亚类,效价分别达到1：128000、1：32000、1：512000和1：4096000。通过Western blot和ELISA方法进一步对抗体特异性进行了验证,四株抗体均能够分别特异性识别SCOT中硝基化Tyr4、Tyr76位点同时和未硝基化SCOT, SCOT中其他3NT位点以及其他硝基化蛋白之间没有交叉反应,其中CN-10、CE-9表现出更强的特异性。抗体为进一步研究生物体内酪氨酸硝基化修饰奠定了基础。
[Abstract]:Nitration is one of the main protein post-translational modifications induced by reactive nitrogen substances under oxidative stress. One of the main products is 3- nitro tyrosine (3NT). Liver mitochondrial succinyl coenzyme A transferase (SCOT) is a kind of important ketone body metabolism, through LC-ESI-MS/MS analysis, the recombinant SCOT in vitro in 4 and 76 tyrosine residues (Tyr4, Tyr76) are considered peroxynitrous acid (ONOO-) of the primary attack sites and generate 3NT. Although lower SCOT tyrosine nitration causes protein activity in diabetes has been confirmed, but SCOT protein abundance and limit the in vivo ionization technique nitration sites cannot accurately detect by mass spectrometry, and the development of specific antibody will facilitate the detection.
【学位授予单位】：湖南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R392
【共引文献】
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，本文编号：1347186
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