CXCR7促进人脐带血来源内皮祖细胞血管生成的研究

发布时间：2017-12-29 04:00

本文关键词：CXCR7促进人脐带血来源内皮祖细胞血管生成的研究　出处：《重庆大学》2012年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：内皮祖细胞（Endothelial progenitor cell, EPC）在生理性和病理性血管生成中起关键作用。EPC募集归巢到血管新生部位，参与血管生成的过程受到众多生化因子的调控。其中，基质细胞衍生因子-1（Stromal cell derived factor1，SDF-1）在EPC存活、动员、归巢及掺入缺血部位形成血管中起重要作用。一直以来，SDF-1被认为是通过其唯一受体CXCR4调控EPC参与血管生成，但最近人们发现SDF-1的另一个作用受体—CXCR7。CXCR7广泛表达于造血系统，心、脑、脾、肺、肾、睾丸和卵巢等器官和多种肿瘤细胞系，并且与SDF-1的结合能力强于CXCR4。CXCR7的发现让人们开始重新审视SDF-1的作用机制。已有的研究发现：CXCR7能够促进细胞存活、增殖、粘附与跨内皮迁移，在肿瘤发生与转移、免疫细胞成熟和干细胞归巢中起重要作用。我们的研究发现CXCR7在EPC中表达，但其功能尚不明确。研究CXCR7在EPC中的功能，对了解血管生成意义重大。本研究以人脐带血来源EPC为研究对象，考察CXCR7对EPC参与血管生成的影响，并初步探讨其作用机制。在此基础上，考察通过腺病毒转染的方法提高EPC细胞CXCR7表达增强EPC血管生成能力的可行性。本文的主要研究内容包括： ①人脐带血来源EPC的分离培养鉴定。采用密度梯度离心法从新生儿脐带血中分离单个核细胞，并结合差时贴壁法，经EGM-2内皮特异性培养基诱导培养后，通过细胞形态、特异性表面标记和内皮功能鉴定EPC。分离出的单个核细胞在EGM-2完全培养基中诱导培养7天后，细胞形态呈圆形或者“鹅卵石”状，并且能够形成典型的细胞集落。细胞免疫荧光显示：培养7天后的单个核细胞CD133及VEGFR-2的阳性率均极高，CD133及VEGFR-2双阳性细胞占总细胞数量90%以上，表明分离出的单个核细胞中有超过90%的细胞为EPC。乙酰化低密度脂蛋白摄取和荆豆凝集素结合实验显示：培养7天后的单个核细胞有超过80%的呈Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1双阳性，表明分离出的细胞有较好的内皮功能。以上结果表明：通过密度梯度离心结合差时贴壁法，通过EGM-2内皮特异性培养基诱导培养，能够从人脐带血中分离出EPC，并且分离出的细胞纯度高、活性好。 ②考察CXCR7在EPC中的表达及功能。Western Blotting检测发现CXCR7在人脐带血来源内皮祖细胞中有表达。与作为阳性对照的Hela细胞相比，其表达较低。流式细胞术检测发现CXCR7主要分布在人脐带血来源EPC胞内，而在细胞膜上几乎不表达。通过小分子拮抗剂预处理EPC阻断CXCR7，我们考察了CXCR7在SDF-1诱导的EPC迁移、增殖、存活、与活化内皮粘附、跨内皮迁移、管样结构形成以及NO和MMP-2分泌中的作用。结果显示：CXCR7单独介导SDF-1诱导的EPC存活，与CXCR4一同介导EPC诱导的管样结构形成和MMP-2分泌，还能促进SDF-1/CXCR4诱导的EPC与活化内皮细胞粘附和跨内皮迁移能力，但在SDF-1诱导的EPC迁移、增殖和NO合成中不起作用。 ③利用Ad-EASY腺病毒质粒系统构建CXCR7高表达腺病毒。从G2细胞总RNA中反转录cDNA，利用CXCR7特异性全长引物扩增CXCR7cDNA全长序列。将CXCR7全长序列与pMD19-T质粒连接并测序。以该质粒为模板，利用带酶切位点CXCR7全长引物扩增出带酶切位点的CXCR7cDNA全长序列。分别双酶切CXCR7全长序列和穿梭质粒pAD Track-CMV，T4DNA连接酶连接后转染DH5α感受态细胞后，卡那霉素(Kan)筛选阳性菌。抽提重组穿梭质粒并测序以确定CXCR7全长序列正确扩增。将重组穿梭质粒用Pme I线性化后，电转入含有AdEASY-1骨架质粒的BJ5183感受态细胞中进行同源重组，Kan筛选阳性菌。抽提质粒通过Pac I酶切筛选重组子，，并通过测序确定重组子中CXCR7全长序列正确扩增。Pac I酶切重组质粒，脂质体法转染HEK293细胞包装病毒。收集病毒进行PCR检验，验证CXCR7高表达腺病毒构建成功，并筛选转染EPC最佳MOI。测序和PCR鉴定结果显示CXCR7高表达腺病毒构建成功，其转染EPC的最佳MOI为100。 ④考察提高EPC中CXCR7表达对EPC血管生成能力的影响。利用自行构建的CXCR7高表达腺病毒，以MOI=100转染EPC构建CXCR7high-EPC工程细胞。WesternBlotting验证腺病毒转染后EPC中CXCR7的表达变化。通过比较CXCR7high-EPC与转染空腺病毒的EPC(wt-EPC)在细胞存活、与活化内皮细胞粘附、在SDF-1诱导下的跨内皮迁移以及体外形成管样结构的能力，考察提高EPC中CXCR7表达能否增强其血管生成能力。结果显示：CXCR7高表达腺病毒转染能够显著提高EPC细胞CXCR7表达。提高CXCR7的表达能够提高EPC在血清剥夺环境下的存活，促进EPC与活化内皮的粘附、SDF-1诱导的跨内皮迁移以及管样结构形成，并且这种促进作用与外源性补充SDF-1有协同作用。综合以上结果，我们得出以下结论：CXCR7在人脐带血来源EPC中低表达，且主要分布在细胞胞内，在细胞膜上几乎不表达。CXCR7单独介导SDF-1诱导的EPC存活，与CXCR4一同介导EPC诱导的管样结构形成和MMP-2分泌，并促进SDF-1/CXCR4诱导的EPC与活化内皮细胞粘附和跨内皮迁移，但在SDF-1诱导的EPC迁移、增殖和NO合成中不起作用。通过腺病毒转染提高EPC中CXCR7表达能够提高EPC在血清剥夺环境下的存活、与活化内皮的粘附、跨内皮迁移以及管样结构形成，而且这种促进作用与外源性添加SDF-1有协同作用。这些结果表明CXCR7是一个调控血管生成的潜在靶标，阻断CXCR7能够抑制EPC血管生成能力，而提高CXCR7表达能够增强EPC血管生成能力。
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【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

【参考文献】