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大鼠骨髓基质干细胞向神经细胞诱导分化及其MASH-1表达的体外研究

发布时间:2017-12-29 03:08

  本文关键词:大鼠骨髓基质干细胞向神经细胞诱导分化及其MASH-1表达的体外研究 出处:《河北联合大学》2011年硕士论文 论文类型:学位论文


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【摘要】:目的: 当今社会,科学技术的高速发展为人们带来高质量的生活,但同时也给人们带来了许多伤害,比如汽车的普及造成越来越多的交通伤等,而这些伤害往往会造成人的中枢神经(大脑、脊髓)及周围神经的损伤,但是至今人们没有找到满意的治疗手段。因为过去人们一直认为神经细胞是不可再生的,所以修复神经也是不可能的。骨髓基质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)所具有的多能分化特性为神经细胞再生的研究提供了新的方向和思路,使得神经细胞再生成为可能。本研究拟通过体外分离、培养大鼠骨髓基质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),观察其生物学特性;对培养的MSCs进行单纯β-巯基乙醇(β-ME)诱导,促使其向神经细胞定向分化并对分化的细胞加以鉴定。探讨诱导后所得细胞神经细胞标志物的表达规律以及MASH-1表达的变化情况,进而探讨MSCs体外诱导分化的条件、特点和规律,为MSCs在神经修复领域的应用奠定理论基础。 方法: 1. MSCs的分离培养:取2月龄SD大鼠,无菌条件下取双侧股骨和胫骨,5ml L-DMEM彻底冲洗髓腔获取骨髓细胞悬液,Percoll液密度梯度离心与贴壁相结合分离、纯化MSCs,进行细胞培养,并换液、传代。每天在倒置相差显微镜下观察原代、传代细胞的形态变化及生长状态。 2.诱导MSCs向神经细胞方向分化:待细胞达80%融合时,分别对第5代、第10代、第15代细胞,进行预诱导和正式诱导。首先加入L-DMEM + 1mmol/Lβ-ME + 20%FBS预诱导24h后,分两组用不同方法继续诱导,第一组加入L-DMEM + 5mmol/Lβ-ME诱导5h,第二组(对照组)加入L-DMEM + PBS诱导5h。倒置相差显微镜下观察诱导后细胞形态的变化。 3.神经细胞鉴定:用免疫组织化学SP法检测神经前体细胞特异标志物:神经巢蛋白(Nestin);神经元特异标志物:神经元中间丝蛋白(NF)、神经元特异性烯醇化酶(NSE);神经胶质细胞标志物:胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。 4.对诱导分化的细胞进行尼氏染色。 5.构建可以表达针对MASH-1的小干涉RNA(siRNA)的干涉载体,使用Lipofenectin2000转染至大鼠MSCs,同样方法转染干扰组和对照组,其中干扰组加入干扰的无义序列siRNA,对照组加入等量的PBS。 6. Real-time PCR法检测MASH-1诱导前后表达的变化情况。 结果: 1. MSCs分离培养:MSCs贴壁生长,培养的各代细胞形态稳定,以成纤维状细胞为主,细胞表现为长梭形。传代后细胞形态和原代细胞相似,无衰老征象。传代细胞比原代细胞增殖更快,前15代细胞7-9d可达到融合。 2. MSCs经诱导后细胞形态变化:MSCs经诱导后形态变化明显,胞体收缩成锥形、球形,突起增多,表现出典型的神经细胞样形态;诱导后形态转化率随时间延长而增加,直到5h达高峰,持续约2-3h,7-8h后细胞开始脱落、凋亡,到24h后几乎全部凋亡。诱导4-5h后形态转化率达到高峰。第5代、第10代、第15代细胞诱导5h后形态转化率分别为84.70±5.42%、84.70±4.42%、86.10±3.81%,经检验三者之间没有统计学差异。对照组无明显变化。 3.免疫细胞化学鉴定结果:免疫组化染色未经诱导的MSCs的NESTIN、NSE、NF和GFAP均为阴性;细胞经诱导5h后,NESTIN表达较诱导1h减弱,而NSE、NF、GFAP表达明显增高。第5代MSCs经诱导5h后NESTIN、NSE、NF、GFAP的表达率分别为:82.25±1.59%、85.79±2.79%、80.71±5.68%、45.71±3.12%。第5、10、15三代细胞各指标阳性表达率相似,没有统计学差异。对照组细胞以上各指标均表达为阴性。 4.尼氏小体染色:诱导1h及5h后形态典型的细胞的胞质中出现深蓝色块状或颗粒状的尼氏小体;未诱导MSCs细胞的胞浆内无尼氏小体。 5.利用Real-time PCR法分别检测正常组、干扰组、MASH-1-siRNA组MASH-1的表达水平。各组MASH-1的Ct值均经β-actin矫正,以正常组的表达作为100%。结果显示,转染组MSCs细胞中MASH-1的mRNA的平均表达为0.09473±0.008537,远低于空白组0.46593±0.01823和阴性对照组0.4583±0.02141,其差异有统计学意义( P 0.01)。 结论: 1.离心与贴壁相结合是一种简便、有效的分离、纯化、扩增MSCs的方法。 2. MSCs经β-ME单纯诱导后可分化为神经元或神经胶质细胞。 3.诱导后细胞具有成熟期神经细胞的超微结构特征(存在尼氏小体),说明该细胞在结构上已具备成熟神经元的某些特征。 4. MASH-1-mRNA在大鼠MSCs中高表达,无义序列的siRNA并不能降低这种表达,但特异性的MASH-1-siRNA却可明显抑制MASH-1-mRNA的表达,同正常组或干扰组比较,差异具有显著性(P0.01),说明特异性的转染MASH-1-siRNA可抑制大鼠MSCs表达MASH-1。
[Abstract]:......
【学位授予单位】:河北联合大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R329

【参考文献】

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本文编号:1348532

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