爆发性肝炎小鼠中髓系衍生抑制性细胞对NK细胞活性影响的研究

发布时间：2017-12-29 10:20

本文关键词：爆发性肝炎小鼠中髓系衍生抑制性细胞对NK细胞活性影响的研究　出处：《浙江大学》2011年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：爆发性肝炎发病迅速,病情重,死亡率高,是目前医学难题之一。机体的免疫应答异常是其特征,人体免疫系统功能的变化与肝炎的发生、发展和预后有着密切的联系。肝脏中含有大量参与天然免疫应答的细胞,如NK细胞、MΦ、NKT和γdT细胞。近年来,具有免疫抑制性的细胞亚群表型为Gr1+CD11b+的髓系衍生抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)越来越受到研究人员的重视,MDSC是髓系来源的异质性细胞群体,包括髓系祖细胞和未成熟的髓系细胞。已有研究表明,MDSCs在机体肿瘤、炎症和感染等疾病的免疫应答中起负向调控作用。本研究就爆发性肝炎发展过程中MDSCs对固有免疫NK细胞的影响展开研究。结合已有的研究报道,我们以C57/BL6小鼠作为实验动物,制备了内毒素引起的爆发性肝炎模型,基于该模型检测爆发性肝炎发生发展过程中,MDSCs与NK细胞数量比例以及NK杀伤活性变化,研究爆发性肝炎过程中MDSCs对NK细胞活性的影响,以期对爆发性肝炎的发病机制有更深入的了解,并为爆发性肝炎的防治提供一定的思路。第一部分：小鼠爆发性肝炎模型的建立与鉴定以C57BL/6小鼠作为实验动物,通过腹腔注射脂多糖(LPS) (5μg/kg)和D-半乳糖胺(D-GalN) (450mg/kg)来制备小鼠爆发性肝炎模型,利用D-GalN辅助下的内毒素中毒来损伤肝脏,模拟爆发性肝炎,检测其肝炎的发生发展状况。首先,我们成功制备了小鼠爆发性肝炎模型并观察了其生存时间。造模小鼠在6.5h后部分出现死亡,7h-8h 75%的小鼠死亡,并在10h内全部死亡。利用该现象,我们进一步检测了小鼠造模后0h、1.5h、3h和6h时血清中谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)的含量,数据表明,小鼠腹腔注射LPS/D-GalN后,随着时间的延长血清AST和ALT的含量均显著升高,6h时血清AST和ALT的含量均显著高于1.5h和3h时血清AST和ALT的含量。同时,我们还对各时间点造模小鼠的肝脏进行了病理学检查。病理切片显示注射LPS/D-GalN 1.5h肝脏病理切片示肝细胞有较多的核分裂,有散在的中性粒细胞浸润；3h肝脏病理切片示肝细胞有较多的核分裂,有散在的中性粒细胞浸润,部分区域呈小灶性炎症细胞浸润,有部分肝细胞死亡；6h肝脏病理切片示肝细胞有较多的核分裂,有较多的中性粒细胞浸润,局部呈小灶性炎症细胞浸润,其周围有大量肝细胞死亡。上述结果表明爆发性肝炎模型随着时间的推移,肝脏炎症显著加重,逐渐出现肝脏坏死。第二部分：小鼠爆发性肝炎发展过程中MDSCs对NK细胞及其活性的影响我们从爆发性肝炎模型小鼠0h、1.5h、3h和6h时肝脏、脾脏、骨髓和淋巴结组织中分离出单个核细胞,用FITC-anti-Gr1和PE-anti-CD11b抗体标记细胞,通过流式细胞仪检测不同时间点Gr1+CD11b+MDSCs的细胞比例；用PE-anti-CD3e和PE-Cy5-anti-NK1.1抗体标记肝脏单个核细胞,检测不同时间点CD3-NK1.1+NK细胞的比例；用FITC-anti-NKG2D、PE-anti-CD3e和PE-Cy5-anti-NK1.1抗体标记肝脏、脾脏和骨髓中的单个核细胞,检测不同时间点NKG2D+NK细胞的比例以及NKG2D的平均荧光强度。结果显示,肝脏、脾脏、骨髓和淋巴结组织中的MDSCs随着爆发性肝炎的发展逐渐聚集,同时肝脏中的NK细胞数量随着爆发性肝炎的发展也不断增加,且表达活化受体NKG2D的NK细胞比例在肝炎爆发状态时也出现了显著升高,NK细胞活化受体NKG2D的平均荧光强度也随着爆发性肝炎的发展显著增强。表明了伴随爆发性肝炎的发展,MDSCs及NK细胞均逐渐增多,NK细胞活性也随之加强。第三部分：小鼠爆发性肝炎发展过程中剔除MDSCs与对NK细胞的影响利用Rb6杂交瘤细胞,通过裸鼠制备具有MDSCs剔除功能的单克隆抗体,然后对制备的anti-Gr-1 mAb进行体内剔除效果的鉴定。C57BL/6小鼠腹腔注射该单克隆抗体后,小鼠肝脏、脾脏和骨髓中细胞Gr1+CD11b+MDSCs的细胞比例显著下降至1%左右,剔除效果明显。随后以anti-Gr-1 mAb制备MDSCs剔除的小鼠,在此基础上,用PE-anti-CD3e和PE-Cy5-anti-NK1.1抗体标记肝脏单个核细胞,检测了爆发性肝炎模型6h时间点肝脏细胞中CD3-NK1.1+NK细胞的比例；并用FITC-anti-NKG2D、PE-anti-CD3e和PE-Cy5-anti-NK1.1抗体标记肝脏、脾脏和骨髓中的单个核细胞,检测爆发性肝炎模型6h时间点NKG2D+NK细胞的比例以及NKG2D的平均荧光强度。结果显示,MDSCs剔除后爆发性肝炎6h时间点肝脏中NK细胞的比例显著高于未剔除组同一时间点NK细胞的比例。另外,体内剔除MDSCs后,小鼠爆发性肝炎6h时间点肝脏、脾脏和骨髓中NK细胞表达活化受体NKG2D的细胞比例与NKG2D的荧光强度均显著降低,表明爆发性肝炎模型小鼠肝脏中MDSCs显著抑制了NK细胞的比例。综上所述,随着爆发性肝炎的发展,Gr1+CD11b+MDSCs在不同组织器官中快速增殖,肝脏中CD3-NK1.1+NK细胞的数量也不断增加,剔除MDSCs促进NK细胞比例的增加,表明MDSCs在肝脏炎症发展过程中一定程度抑制了NK细胞数量的增加,但无法根本性地扭转肝炎的急性爆发及NK细胞活性增强导致的肝细胞损伤,本研究对于爆发性肝炎的发病机制及治疗提供了新的思路。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R392

【参考文献】