HIF-1a调控VEGF对离体原代培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响

发布时间：2017-12-30 06:00

本文关键词：HIF-1a调控VEGF对离体原代培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响　出处：《南华大学》2011年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景:氧感受器:据知低氧诱导因子1(HIF-1)是细胞适应低氧的关键转录因子,在低氧性肺动脉高压(HPH)也起十分重要的作用,它由氧敏感的α亚基(HIF-1α)和在核内稳定表达的β亚基(HIF-1β)组成的异二聚体转录因子。HIF-1α作为是功能性亚基,可以调控100多种涉及低氧应激下细胞适应与存活的靶基因的表达,从而在低氧应答反应中起核心作用,因而也称为是最新一种的氧感受器。是低氧性肺血管重塑(HPSR)形成中调控目标基因表达的“分子开关”。低氧诱导因子脯氨酰羟化酶(PHD1)是一种可以使HIF-1α脯氨酸残基羟基化并调节其对氧稳定性的重要的关键性酶;低氧诱导因子抑制因子(FIH)是调节HIF-1α转录激活活性的另外一种关键酶。它们通过氧敏感的方式调节低氧诱导因子活性及其表达。目的:体外原代培养大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs),研究低氧下对大鼠PASMCs增殖的影响以及HIF-1α、PHD1、FIH、及HIF-1α靶基因血管内皮生长因子(VEGF)在肺动脉平滑肌细胞中的表达变化的规律及相互关系;观察HIF-1a基因过表达和沉默对PASMC中VEGF的表达的影响,为HPH发病机制提供新的理论依据。方法:实验共分两部分。第一部分,将SD大鼠消毒后剖开胸腹腔,无菌下取出心肺组织,然后分离出肺动脉段,分离大鼠肺动脉中膜层,用组织块贴壁法培养,倒置相差显微镜观察细胞形态、普通免疫组织化学法(SP法)和免疫荧光法进行细胞鉴定。然后将体外培养的大鼠PASMCs,设计常氧组、低氧组H2,H6,H12,H24。用四唑盐(MTT)比色法测各组PASMCs增殖。用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测各组细胞HIF-1α、PHD1、FIH、VEGF mRNA表达水平,Western blotting法检测HIF-1α、PHD1、FIH、VEGF的蛋白表达水平。第二部分,将HIF-1a基因转染在大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells, PASMCs)中,将细胞分为过表达HIF-1α组、对照组(未转染组)和沉默HIF-1α组。经常氧和低氧处理后分别用Western blotting法检测HIF-1α和VEGF的蛋白表达水平。结果:(1)在不使用显微技术情况下,用组织贴块法成功培养大鼠PASMCs,得到稳定生长、纯度高的PASMCs,且培养与纯化可以同时进行,可获得稳定传代的细胞。 (2)采用MTT法发现,低氧2小时后肺动脉平滑肌细胞明显增殖,低氧24小时后细胞增殖达高峰,此后增殖稍下降。HIF-1αmRNA和HIF-1α蛋白在常氧组表达阳性,低氧2小时后表达明显增高,低氧6小时后达高峰,此后表达稍下降。PHD1 mRNA和蛋白在常氧组均呈阳性表达,在低氧后表达下降。FIH mRNA和蛋白在常氧组均呈阳性表达,在低氧后表达下降。VEGF mRNA和蛋白在对照组表达少量,低氧2小时后表达升高,低氧12小时后达高峰。 (3)在常氧下siRNA成功沉默HIF-1a基因后(siRNA-HIF-1a组),PASMCs中HIF-1a和VEGF蛋白表达明显减少,对照组(未转染组)表达较siRNA-HIF-1a组增多,过表达HIF-1a组HIF-1a蛋白表达明显增加;在低氧下,siRNA-HIF-1a组HIF-1A和VEGF蛋白仅少量表达,对照组开始增加,过表达组明显增加,且低氧下各组HIF-1a和VEGF蛋白表达较常氧下各组均高。 (4)直线相关分析结果表明:在低氧大鼠肺肺动脉平滑肌细胞HIF-1αmRNA及蛋白与VEGF mRNA、VEGF蛋白均呈正相关。HIF-1α、VEGF蛋白与平滑肌细胞增殖正相关。FIH、PHD1mRNA及蛋白与VEGF mRNA、VEGF蛋白均呈负相关。FIH、PHD1蛋白及mRNA与HIF-1a mRNA、HIF-1a蛋白均呈负相关。结论:(1)低氧能促进肺动脉平滑肌细胞的低氧性增殖。(2)低氧可诱导肺动脉平滑肌细胞HIF-1a的表达。(3)HIF-1α、VEGF均参与肺动脉平滑肌细胞的增殖过程,HIF-1α可能以转录激活的形式上调VEGF表达,导致平滑肌细胞的增殖。(4)在低氧性肺动脉平滑肌细胞中,PHD1及FIH表达下降,从而减弱了PHD1和FIH对HIF-1α转录激活活性的抑制,导致VEGF等HIF-1α靶基因转录激活,促使肺动脉平滑肌细胞的增殖。
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【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R363

【参考文献】