抗TRPC6多肽单克隆抗体的制备、鉴定及其初步应用

发布时间：2017-12-30 18:49

  本文关键词：抗TRPC6多肽单克隆抗体的制备、鉴定及其初步应用　出处：《广东药学院》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：1研究目的与意义 本实验目的是为了制备抗TRPC6多肽单克隆抗体，并在此基础上建立单抗-单抗夹心ELISA法测定体系。研究的意义在于所建立的ELISA测定体系用于各种组织和细胞中TRPC6蛋白过表达的测定，并可以进一步辅助局灶节段性肾小球硬化(Focal Segmental Glomerulo Sclerosis, FSGS)的诊断；所制备的单克隆抗体能广泛应用于免疫标记技术（如金标记、荧光标记、同位素标记等），因此，本研究不论在医学研究领域还是临床诊疗技术中均有着重要的应用价值。 2研究的主要内容、方法和结果 2.1TRPC6多肽设计与合成 瞬时受体电位阳离子通道6(Transient Receptor Potential Channel, TRPC6)是由931个氨基酸组成的六次跨膜结构的通道蛋白。根据多肽设计原则，利用蛋白质软件分析方法，从5段氨基酸序列中筛选出序列-KDLTKVTLGDNVKYY，该序列为15个氨基酸，为TRPC6分子中的565-579段序列，其在抗原性、亲水性、柔韧性及结构分析上均符合设计要求，多肽经合成后纯度＞98%，在与钥孔嘁蓝蛋白（KLH）进行偶联后，成为制备单克隆抗体的免疫原。 2.2抗TRPC6多肽单克隆抗体的制备与鉴定 利用偶联后的TRPC6多肽抗原免疫Balb/c小鼠，三次免疫，通过间接ELISA法检测血清免疫效价，选取免疫效价高的小鼠进行加强免疫。采用聚乙二醇法将免疫小鼠的脾细胞与小鼠的骨髓瘤细胞（P3-X63-Ag8.653）融合，用HAT选择培养基筛选融合细胞，，克隆生长孔用间接ELISA法检测上清效价，筛选出阳性克隆，再经过三次有限稀释法克隆化，初步得到7株阳性率100%的分泌抗体的杂交瘤细胞，命名为A2、D8、E9、G3、G11、H8和F11。在此基础上经过反复筛选建立杂交瘤细胞系，最终得到分泌抗体稳定的三株杂交瘤细胞系，分别为A2、H8和F11，经鉴定A2、H8和F11均为IgG1类，轻链类型均为κ型；3株腹水纯化后效价分别为A2（1:1600）、H8（1:3200）和F11（1:1600），纯化后浓度A2为4.1mg/ml，H8为1.04mg/ml，F11为1.03mg/ml。经SDS-PAGE电泳分析结果，重链分子量约55KD，轻链分子量约为25KD，Bandscan软件分析三株纯度均大于90%；相对亲和力测定结果可见H8和F11相近，均为6μg/ml，A2的相对亲和力较低，为12.5μg/ml；单克隆抗体相加实验结果显示H8和F11为针对相同的抗原表位，A2与H8、F11均为针对不同抗原表位，通过配对实验确定A2和F11为最佳配对方案，并进行双抗体夹心法ELISA体系的构建。 2.3双抗体ELISA法体系的建立及初步应用 在确定以A2和F11作为最佳配对的基础上建立双抗体夹心ELISA法检测方法，初步应用于检测大鼠脑部TRPC6蛋白表达水平。为了确定最佳包被抗体量和酶标抗体量，首先采用cELISA试验鉴定单抗的敏感性，F11的IC50为0.6μg/ml，A2的IC50为2.8μg/ml，说明F11的灵敏度要高于A2。 采用方阵滴定法确定包被A2的最佳浓度为1:200，5μg/ml，HRP-F11的最佳浓度为双抗体的最佳稀释浓度为1:150，7μg/ml；采用双抗体夹心ELISA法建立检测TRPC6蛋白水平的标准曲线，在0.625μg/ml-10μg/ml范围内呈线性相关，回归方程为y=0.0519x+0.1869，相关系数R2=0.992，P0.05，说明本实验建立的双抗体夹心ELISA法检测蛋白水平是可靠的，但最佳反应条件还需要进一步优化和多样本的检测。通过建立的双抗体夹心ELISA方法测定大鼠脑蛋白中TRPC6含量，用于组织细胞中TRPC6蛋白过表达的检测。 3通过以上实验，可得以下结论 3.1通过抗原性、亲水性和柔韧性等比较，最终筛选出KDLTKVTLGDNVKYY作为TRPC6多肽合成序列，合成多肽与KLH偶联后可用于免疫动物的免疫原。 3.2通过合成肽抗原免疫小鼠制备了抗TRPC6多肽单克隆抗体，并建立了三株杂交瘤细胞系（A2、F11、H8），其中H8与F11的相对亲和力相似，而且均大于A2，经抗体相加实验得出H8与F11针对相同抗原位点，而其中F11与A2针对不同抗原位点，因此可用于双抗体夹心ELISA方法的构建。 3.3初步建立了检测TRPC6蛋白的双抗体夹心法，该方法可初步应用于组织细胞中TRPC6蛋白过表达的检测。
[Abstract]:1 Study Purpose and Significance The purpose of this study was to prepare the monoclonal antibody against TRPC6 polypeptide and to establish a single - antibody - McAb sandwich ELISA assay . The significance of this study was that the established ELISA assay was used for the determination of TRPC6 protein overexpression in various tissues and cells , and it could be used in the diagnosis of focal segmental glomerulosclerosis ( FSGS ) . 2 Main contents , methods and results of the study 2.1 TRPC6 polypeptide design and synthesis Transient receptor Potential Channel ( TRPC6 ) is a channel protein of six transmembrane structures composed of 931 amino acids . According to the principle of polypeptide design , the sequence - KDLTKVTLGDNVKYY is screened from the amino acid sequence of 5 segments . 2.2 Preparation and identification of monoclonal antibodies against TRPC6 polypeptide Three hybridoma cell lines ( A2 , 8 , 9 8 , 9 8 , 3 , 1 : 1600 ) were screened by indirect ELISA . The results showed that the two hybridoma cell lines were identified as A2 , 8 , 9 8 , 8 9 , 3 3 , 1 . 3 mg / ml . The results showed that the two hybridoma cell lines with the highest positive rate were A2 ( 1 : 1600 ) , 8 8 ( 1 : 3200 ) and F11 ( 1 : 1600 ) . The results showed that the two hybridoma cell lines with the highest positive rate were identified as A2 , 8 , 9 , 9 , 11 , 12 . 5 渭g / ml . 2.3 Establishment and Preliminary Application of Double - antibody ELISA System In order to determine the optimum amount of antibody and the amount of antibody , the IC50 of F11 was 0.6 渭g / ml , the IC50 of F11 was 2.8 渭g / ml , and the sensitivity of F11 was higher than A2 . The optimal concentration of HRP - F11 was 1 鈭

本文编号：1356029