黑暗链霉菌aprD3和aprD4基因的研究及卡那霉素B高产菌株的构建

发布时间：2017-12-31 00:05

本文关键词：黑暗链霉菌aprD3和aprD4基因的研究及卡那霉素B高产菌株的构建　出处：《沈阳药科大学》2011年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：黑暗链霉菌主要产生氨甲酰妥布霉素、氨甲酰卡那霉素B和安普霉素三种抗生素,氨甲酰妥布霉素和氨甲酰卡那霉素B是4,6取代2-脱氧链霉胺类氨基糖苷抗生素,而安普霉素是4取代2-脱氧链霉胺类抗生素,且结构中有一独特的八碳糖。氨甲酰妥布霉素和氨甲酰卡那霉素B结构非常相似,差别只在氨甲酰卡那霉素B的C-3’位为羟基而氨甲酰妥布霉素C-3’位为氢,安普霉素虽然与它们结构有较大差异,但其C-3’位也为氢。推测氨甲酰妥布霉素和氨甲酰卡那霉素B为同一生物合成途径合成,其生物合成基因簇为妥布霉素生物合成基因簇,而安普霉素有其独立的生物合成途径,妥布霉素生物合成基因簇和安普霉素生物合成基因簇均已经被克隆。由于氨甲酰妥布霉素和安普霉素结构中都有C-3’位脱氧结构,且前体的对应位置为羟基,所以推测它们的生物合成途径中有C-3’位脱氧这一过程。因此,通过实验证实氨甲酰妥布霉素和安普霉素生物合成中C-3’脱氧有关的基因不仅可以为2-脱氧链霉胺类氨基糖苷抗生素的脱氧机制研究打下基础,而且可以在此基础上通过基因工程的方法构建只产目标产物的组份优化的菌株。对已经报道的氨基糖苷类抗生素合成基因进行生物信息学分析,推测安普霉素生物合成基因簇中的aprD3和aprD4可能参与安普霉素和妥布霉素生物合成中的脱氧。为了研究aprD3基因的功能,通过基因阻断试验对其进行阻断。以黑暗链霉菌H6总DNA为模板PCR扩增同源片段,构建阻断质粒。质粒通过接合转移的方法转化黑暗链霉菌H6,依次筛选单交换和双交换菌株。与出发菌株相比,aprD3阻断变株产生一新的抗生素。通过质谱和核磁对其结构进行确证,证实该新组分为氧化安普霉素,说明AprD3参与安普霉素生物合成中脱氧过程。AprD3是首个得到实验证实的参与2-DOS类氨基糖苷类抗生素的脱氧结构形成的酶。通过基因阻断试验对aprD4基因功能进行研究,aprD4阻断变株不再产生氨甲酰妥布霉素,而氨甲酰卡那霉素B的产量大幅度提升,同时产生氧化安普霉素,说明AprD4同时参与氨甲酰妥布霉素和安普霉素生物合成中脱氧过程。氨甲酰卡那霉素B经水解能够得到卡那霉素B,卡那霉素B是合成抗生素地贝卡星和阿贝卡星的原料。如果能得到卡那霉素B组份优化的高产菌株,将具有重大的应用价值。为阻断安普霉素和氨甲酰妥布霉素的合成,构建基因阻断质粒,将黑暗链霉菌H6基因组删除4.2kb片段,该片段包括完整的aprQ基因和aprD3、aprD4部分序列。对阻断变株SPU313进行发酵培养,对发酵产物进行鉴定。阻断变株只产生氨甲酰卡那霉素B,而不再产生其他抗生素。对阻断变株效价进行测定,氨甲酰卡那霉素B的产量是出发菌株H6的五倍。但氨甲酰卡那霉素B需经水解才能得到卡那霉素B,为了直接发酵生产卡那霉素B,将负责氨甲酰基转移的基因tacA进行阻断,从而得到了卡那霉素B高产菌株。证明通过基因工程方法不仅可以去除杂质组分,而且可以得到原始菌株中不产生的目标产物。
[Abstract]:The C - 3 ' deoxy chain was synthesized by means of gene engineering , but the C - 3 ' position was hydrogen . In order to study the function of aprD3 gene , it was blocked by means of gene block test . The gene function of aprD4 was studied by means of gene block test . The aprD4 blocked mutant no longer produced carbactobramycin , but the yield of carbamycamycin B was greatly improved , meanwhile , the production of oxapramycin was produced , which showed that AprD4 was simultaneously involved in the deoxidation process in the biosynthesis of carbactobramycin and apramycin . A high - yield strain of kanamycin B can be obtained by hydrolysis to obtain kanamycin B .

【学位授予单位】：沈阳药科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R378

【参考文献】