TNF-α通过α7nACHR调节内皮祖细胞功能

发布时间：2017-12-31 10:11

  本文关键词：TNF-α通过α7nACHR调节内皮祖细胞功能　出处：《第二军医大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，是一种能直接分化为血管内皮细胞的前体细胞，不仅参与人胚胎血管生成，而且也参与出生后的血管新生及血管内皮损伤后的修复过程。在炎症反应中，内皮细胞不仅是参与者，还是首先受损的靶细胞，进而造成微血管损伤、微循环障碍，这可能是器官功能障碍的始发环节。大量的动物和临床试验已经证明：创伤时，循环及组织中的EPCs动员、增殖，并分化为内皮细胞修复损伤的血管内皮细胞，从而改善微循环，增加器官供血；而如果创伤严重，发生EPCs的调节失代偿，则会导致微循环的损伤无法修复，进一步加重器官损害，直至功能衰竭，发生MODS。 近年来，临床上通过内皮祖细胞移植治疗心脑血管疾病、肿瘤血管形成及创伤等缺血性疾病取得了重要成功，显示了广阔的应用前景。但是从在临床应用上也存在一定的限制：一是培养数量有限，不能满足临床治疗需要；二是培养时间较长，容易导致延误最佳的治疗时间。 烟碱样乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors, nAChR)α-7亚型属于配体门控型离子通道受体，，是迷走神经激活的“胆碱能抗炎通路”的一个重要成分，机体能通过胆碱能抗炎通路调节炎症过程中肿瘤坏死因子（TNF）、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）和其他细胞因子的水平。研究发现，在血管内皮祖细胞表面表达α7nACHR，且对EPCs的功能调节发挥重要作用。 本研究通过对乙酰胆碱烟碱样受体的干预观察肿瘤坏死因子（TNF-α）对EPCs调节作用的变化，研究阐明TNF-α通过α7nACHR发挥对EPCs的调节作用。为各种炎症、创伤等引起的MODS的临床预防、早期治疗、甚至逆转MODS病情进展提供理论依据。 本研究分为两部分，首先从脐静脉血分离培养内皮祖细胞，并进行鉴定及检测其增殖、迁移及成血管能力等；其次观察TNF-α对EPCs的调节作用受α7nACHR的激动剂及抑制剂的影响，探讨肿瘤坏死因子对内皮祖细胞的调节机制。全文共分两个部分： 第一部分脐静脉血内皮祖细胞的分离、培养及鉴定 目的：从脐静脉血分离培养内皮祖细胞，为下一步研究打好实验基础。 方法：用密度梯度离心法从脐静脉血中分离出单个核细胞，按照1×10~6/cm~2的密度接种于培养皿内，使用添加了细胞因子和胎牛血清的内皮祖细胞专用培养液进行诱导分化培养，在固定时间进行消化、传代和扩增。通过细胞形态学特征、细胞的超微结构、免疫组化、流式细胞仪技术、乙酰化的低密度脂蛋白（Dil-Ac-LDL)和FITC标记的荆豆凝集素-1（FITC-UEA-1）的吞噬功能、体外血管生成功能等方法对其进行鉴定为正在分化的EPCs。Werstern Blot（蛋白免疫印迹法）检测内皮祖细胞表达α7nACHR。 结果：培养2天后逐渐出现梭形贴壁细胞（attaching cells, AT cells)，第5天逐渐出现贴壁细胞聚集形成集落，到7-9天，贴壁细胞可铺满培养皿底。P4代EPCs电镜观察可见：细胞内可检测到典型的Weibel-Palade小体。超过80%体外培养的贴壁细胞都特异性地摄取了Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-1。免疫组化结果显示：CD133（+）、CD34（++）、CD31（+++）、KDR（+++），CD133（+）、CD34（++）、CD31（+++）、KDR（+++）。流式细胞仪技术鉴定：CD133的阳性率：19.14±4.06%，CD34的阳性率：45.08±6.15%，CD31的阳性率：79.62±11.24%，KDR的阳性率：85.32±12.09%。体外血管生成功能：22.92±8.62个/HP。粘附功能：贴壁率为53.04±4.80%。迁徙功能：迁徙率为14.41±1.65%。增殖功能：7天增殖细胞数是19.16±3.66×104。 结论：以脐静脉血为来源可以分离培养出的内皮祖细胞数量稳定，具有典型内皮祖细胞形态特点及各种功能，表面表达α7nACHR，为下一步的研究提供技术支持。 第二部分：TNF-α通过α7nACHR调节内皮祖细胞功能的研究 目的：旨在探讨炎症介质对EPCs调节途经是通过烟碱样乙酰胆碱受体，为临床应用相关疾病提供理论依据。 方法：实验选取10个培养皿，均加入TNF-α(100mg/L)，随机选取其中5个作为A组，依次加入尼古丁（0、10-8、10-6、10-4、10-2mol/L），标为A1-5；其余5个分为B组，依次加入甲基牛扁亭碱（0、10-8、10-6、10-4、10-2mol/L），标为B1-5。分别培养T1-3（12h、24h、48h）后行流式细胞仪检测、 Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1摄取实验、体外血管生成实验、EPCs增殖功能、粘附功能及迁徙功能检测。 结果：流式细胞术检测（阳性率）：A1-A5：CD133：18.67±4.06%，CD34：47.08±7.08%，CD31：82.16±8.89%，KDR：89.02±8.28%；B1-B5：CD133：16.19±6.04%，CD34：48.12±6.34%，CD31：80.43±9.01%，KDR：87.24±9.12%。体外血管生成功能：A1-A5：20.02±4.67个/HP；B1-B5：10.38±7.55个/HP。粘附功能（贴壁率）：A1-A5：48.14±5.78%；B1-B5：29.08±5.12%。迁徙功能（迁徙率）：A1-A5：12.82±1.44%；B1-B5：4.87±0.82%。增殖功能：培养7天增殖细胞数：A1-A5：18.87±4.45×10~4；B1-B5：4.12±1.02×10~4。 结论：TNF-α可降低EPCs的增殖、迁移、黏附和体外血管形成能力，且受胆碱 小结：机体在炎症、创伤等过程中，体内EPCs的数量减少及功能障碍可能是导致MODS发生发展的重要原因之一。TNF-α作为重要的炎症因子在此过程中起到不可或缺的作用。而TNF-α对EPCs数量及功能的调节，烟碱样乙酰胆碱能通路可能是一条重要途径。因此在炎症创伤早期，通过对α7nACHR的干预，可阻断炎症因子对EPCs的破坏，从而为MODS的早期防治、临床治疗，甚至防止MODS的发生提供可能的治疗方法。
[Abstract]:Endothelial progenitor cells (endothelial progenitor, cells, EPCs) is a kind of can directly differentiate into vascular endothelial precursor cells, not only involved in human embryonic angiogenesis, but also participate in the repair process of angiogenesis and vascular endothelial injury after birth. After in inflammation, endothelial cells are not only the target participants. Cells are first damaged, causing the microvascular injury, microcirculation, which may be the earliest part of MODS. A large number of animal and clinical trials have proved that the trauma, circulation and tissue EPCs mobilization, proliferation, and differentiation of endothelial cells to repair damaged endothelial cells, improve microcirculation, increase if the organ blood supply; severe trauma, EPCs regulation will lead to decompensation, microcirculation damage can not be repaired, further aggravate organ damage, until failure occurred, MODS.
In recent years, the clinical through endothelial progenitor cell transplantation in the treatment of cardiovascular and cerebrovascular diseases, tumor angiogenesis and wound ischemic disease has achieved important success, shows a wide application prospect in clinical application. But from there are certain limitations: one is to develop a limited number, can not meet the needs of clinical treatment; two is to train a long time, easily lead to delay the best treatment time.
Nicotinic acetylcholine receptors (nicotinic, acetylcholine receptors, nAChR -7) alpha subtype belongs to the ligand gated ion channel receptor, activation of the cholinergic vagus nerve is an important component of anti-inflammatory pathway, the body through the cholinergic anti-inflammatory pathway of tumor necrosis factor in the regulation of the inflammatory process (TNF), high mobility group protein B1 (HMGB1) and other cytokines. The study found that the expression of alpha 7nACHR in the surface of vascular endothelial progenitor cells, and the function of EPCs regulation play an important role.
The effects of tumor necrosis factor by acetylcholine nicotinic receptor intervention (TNF- alpha) change regulation of EPCs, shows that TNF- alpha plays an important role in regulating EPCs by alpha 7nACHR. For a variety of inflammation, early treatment of MODS clinical prevention, trauma, or even reverse the progression of MODS and provide a theoretical basis.
This study is divided into two parts, first isolated and cultured endothelial progenitor cells from umbilical vein blood, and identify and detect the proliferation, migration and angiogenesis ability; secondly effects regulated by TNF- alpha EPCs alpha 7nACHR by agonists and inhibitors, to explore the mechanism of tumor necrosis factor on endothelial progenitor cells this paper is divided into two parts:
The first part of the separation of endothelial progenitor cells, culture and identification
Objective: to isolate and culture endothelial progenitor cells from umbilical vein blood, and to lay a good foundation for the next study.
Methods: isolated by density gradient centrifugation from umbilical cord blood mononuclear cells, according to 1 * 10~6/cm~2 were inoculated in culture dishes, supplemented with endothelial progenitor cells in special culture medium and fetal bovine serum cytokines to induce the differentiation of cultured by digestion in a fixed time, and amplified by cell passage. The morphological characteristics, cell ultrastructure, immunohistochemistry, flow cytometry, acetylated low density lipoprotein (Dil-Ac-LDL) and FITC -1 labeled Ulex europaeus agglutinin (FITC-UEA-1) phagocytosis, in vitro angiogenesis function method for its identification for differentiating EPCs.Werstern Blot (Western blot) detection of endothelial progenitor cells expressing alpha 7nACHR.
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本文编号：1359310