GDF-5诱导人骨髓间充质干细胞“自组装”修复软骨缺损的研究

发布时间：2018-01-02 10:40

  本文关键词：GDF-5诱导人骨髓间充质干细胞“自组装”修复软骨缺损的研究　出处：《华中科技大学》2011年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：第一部分GDF-5促进成人骨髓间充质干细胞成软骨分化的研究 目的探讨生长分化因子5(GDF-5)诱导成人骨髓间充质干细胞(human bone mesenchymal stem cells, BMSCs)成软骨细胞分化的可行性及最佳诱导浓度。 方法采用全骨髓培养法分离培养BMSCs,流式细胞仪检测BMSCs表面CD45,CD14,CD44,CD29和CD105表达。不同诱导培养基诱导成人BMSCs,采用油红0和茜素红染色检测成脂,成骨分化情况。采用含0、10、50、100 ng/ml GDF-5的软骨诱导液诱导培养BMSCs 21天,倒置显微镜观察细胞形态变化；RT-PCR检测不同浓度GDF-5组细胞Ⅱ型胶原和Aggrecan表达；免疫组化检测Ⅱ型胶原表达；番红0和阿里新蓝染色检测蛋白多糖表达。 结果成人BMSCs呈梭形漩涡状生长,CD29、CD44、CD105表达阳性,CD14、CD45呈阴性表达,并具有向脂肪,骨等组织多向分化的潜能。GDF-5诱导7天后细胞形态逐渐由长梭形向多边形、多角形转化。不同浓度GDF-5诱导21天,Ⅱ型胶原表达量各组间差异均具有统计学意义(P0.05)；Aggrecan的表达CM组和10 ng组之间差异无统计学意义(P0.05),其它各组间差异均具有统计学意义(P0.05)。免疫组化检测Ⅱ型胶原表达阳性,阿里新蓝和番红0染色均为阳性。 结论全骨髓培养法成功分离培养BMSCs,含100 ng/ml GDF-5软骨诱导液能有效促进成人BMSCs向软骨表型分化。 第二部分GDF-5诱导的人骨髓间充质干细胞“自组装”构建组织工程软骨 目的探讨以生长分化因子5(GDF-5)诱导的人骨髓间充质干细胞(BMSCs) "自组装”(Self-Assembly)构建组织工程化软骨的可行性和最佳方法。 方法分离培养人骨髓间充质干细胞,取第4代人骨髓间充质干细胞。将实验分成四组：BMSCs消化后分别悬浮于软骨诱导液中(CM1组)和含100 ng/ml GDF-5的软骨诱导液中(D1组)自组装培养6周；BMSCs先用含100 ng/ml GDF-5的软骨诱导液在培养瓶中诱导3周消化后分别悬浮于软骨诱导液中(CM2组)和含100 ng/ml GDF-5的软骨诱导液(D2)中自组装培养6周。分别对4组自组装组织团块进行大体观察；HE染色观察自组装组织细胞结构；免疫组织化学检测组织Ⅱ型胶原和Ⅹ型胶原表达、阿利新蓝染色检测组织蛋白多糖表达；采用生化分析组织团块GAG,总胶原,细胞数目变化。 结果四组自组装组织团块均具有类似软骨的外观,其中相同细胞接种密度下,D2组形成组织团块直径最大,含水量最高,具有更高的干重和湿重；免疫组织化学结果显示D2组Ⅱ型胶原表达最强,Ⅹ型胶原表达最弱；阿里新蓝染色显示D2组蛋白多糖含量最高；生化分析显示自组装培养6周,D2组具有更高的糖胺聚糖(GAG),总胶原含量,团块含有的细胞数目最多。 结论采用“自组装”技术培养GDF-5诱导的人骨髓间充质干细胞能够形成具有类似软骨形态,组织学和分子生物学特性的组织团块,GDF-5预诱导的BMSCs在GDF-5持续存在条件下,自组装形成的组织团块更具有天然软骨的特性。 第三部分“自组装”工程化软骨在裸鼠体内的生物学改建 目的应用“自组装”培养技术联合生长分化因子5 (growth differentiation factor5,GDF-5)体外构建工程化软骨,比较裸鼠体内植入前后软骨相关生物学特性的差异,探讨“自组装”工程化软骨临床应用的可行性。 方法全骨髓培养法分离培养成人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)。将第4代BMSCs用含100 ng/ml GDF-5的软骨诱导液定向诱导培养,诱导3周后重悬细胞,以1×107／ml的细胞终浓度接种于2%琼脂糖包被的24孔板,行自组装培养,体外培养6周后部分标本植入裸鼠皮下,再经体内6周后取材。通过大体观察、糖胺聚糖含量(GAG)测定、组织学、免疫组化以及RT-PCR等方法对体内植入前后标本的软骨相关生物学特性进行比较。 结果体外培养6周时预分化的BMSCs'“自组装”形成了软骨样组织,但质地较软。体内植入6周后,“自组装”工程化软骨能维持良好的软骨外观,GAG含量明显高于体外标本(P0.05),组织学可见成熟软骨陷窝,免疫组织化学结果显示体内标本的异染基质及Ⅱ型胶原显色程度均明显强于体外标本。RT-PCR检测Ⅱ型胶原和aggrecan mRNA呈阳性表达。 结论应用“自组装”技术联合GDF-5构建的工程化软骨在裸鼠体内皮下环境中能维持良好的软骨特性,并且体内环境能促进其生物学改建及进一步发育成熟。 第四部分“自组装”工程化软骨体外修复人关节软骨缺损 目的探讨用生长分化因子5(growth differentiation factor 5, GDF-5)诱导人骨髓间充质干细胞(bone-derived marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)联合“自组装”(Self-assembly)技术构建的工程化软骨体外修复关节软骨缺损的可行性及其转归。 方法全骨髓法分离培养成人骨髓间充质干细胞(human bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs)。将第4代BMSCs用含100 ng/ml GDF-5的软骨诱导液定向诱导,3周后用含生长分化因子5的软骨诱导液重悬细胞,以1×107/ml的细胞密度接种于2%琼脂糖包被的24孔板,每孔400μ,行自组装培养,3周后对标本行大体和组织学观察并采用生物化学法检测软骨相关的生物学特性。然后将部分标本植入到体外全层软骨缺损模型内,培养3周观察软骨缺损的修复效果,并比较修复前与修复后标本的软骨相关生物学特性变化情况。 结果体外培养3周时预分化的BMSCs "自组装”形成一软骨样组织,组织学检测到软骨特异性成分阳性表达。全层软骨缺损修复模型体外培养3周后,大体和组织学可见缺损由工程化软骨所修复,交界面发生整合,呈紧密连接状,Ⅱ型胶原和蛋白多糖呈阳性表达,但弱于未移植组。同时检测到Fibronectin在软骨缺损修复模型内的交界区有强阳性表达。生化结果显示移植组标本的细胞数、GAG和总胶原含量均低于未移植组(P0.05)。RT-PCR结果也反映出这一变化。 结论“自组装”工程化软骨能有效地修复体外关节软骨缺损,并且能较稳定地维持软骨表型。
[Abstract]:Effect of GDF - 5 on chondrogenic differentiation of adult bone marrow mesenchymal stem cells Objective To investigate the feasibility and optimal concentration of growth differentiation factor 5 ( GDF - 5 ) in inducing differentiation of adult bone marrow mesenchymal stem cells ( MSCs ) into chondrocytes . Methods The bone marrow cells were isolated and cultured by full - bone marrow culture method . The expressions of CD29 and CD105 were detected by flow cytometry . The cells were induced by different induction culture medium . The expression of collagen and Aggrecan was observed by using oil red 0 and alizarin red staining . The expression of type 鈪，

本文编号：1368880