人ORMDL3基因的转录调控研究

发布时间：2018-01-02 19:35

  本文关键词：人ORMDL3基因的转录调控研究　出处：《南京医科大学》2012年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目的： 克隆人血清类黏蛋白1样蛋白3(orosomucoid1-like protein3, ORMDL3)基因启动子并寻找其最小活性区域；鉴定调控ORMDL3基因的关键转录因子；克隆和鉴定ORMDL3基因新剪接异构体，，为阐明其转录调控机制奠定基础。 方法： 采用5’端和3’端cDNA末端快速扩增法(rapid amplification of cDNA ends,RACE)确定ORMDL3基因的转录起始位点及寻找新剪接异构体。以HEK293细胞基因组DNA为模板，采用PCR方法获取ORMDL3基因5’侧翼序列及一系列5’端缺失体，定向插入pGL3-Basic载体。运用双萤光素酶报告基因检测系统鉴定其启动子活性并确定启动子最小活性区域。利用点突变技术、RNA干扰、转录因子过表达、染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecitation，ChIP)及Sequential ChIP等实验，鉴定调控ORMDL3基因的关键转录因子。PCR扩增出ORMDL3野生型及新剪接异构体ORMDL3V1编码序列(Coding Sequence, CDS)，定向插入pEGFP-C1载体，转染细胞分别提取蛋白行Western blot分析了解它们在细胞内表达及荧光显微镜观察它们的亚细胞定位。 结果： 在HEK293细胞中，5’-RACE实验发现ORMDL3基因具有多个转录起始位点，它们位于翻译起始密码子ATG上游34到143bp位。将构建的ORMDL3基因5’侧翼序列(pGL-1318/+58)及一系列截短片段的重组报告质粒转染入HEK293、HeLa和A549细胞，萤光素酶活性分析结果显示：从-1316bp缺失到-84bp位后，仍具有较高的启动子活性，但当缺失到-8bp位时，基本与阴性对照质粒pGL3-Basic活性相当，提示ORMDL3启动子最小活性区域位于-84～+58bp区域，而且在-84～-9bp区域之间存在重要的调控元件。生物信息学预测该区域包含了Ets-1，SRY，p300，WHNF，SP1(A，B)，AhR/Arnt，EIk-1，NRF-1和CREB结合位点，点突变结果表明Ets-1、 p300和CREB位点维持了ORMDL3的基本转录活性。RNA干扰、转录因子过表达、ChIP和SequentialChIP实验结果表明Ets-1、 p300和CREB转录因子能与ORMDL3的启动子区结合并正向调控ORMDL3的表达，其中Ets-1和p300在转录调控中起协同作用。在HeLa细胞中，通过5’-RACE和3’-RACE实验发现了一种ORMDL3新的剪接异构体ORMDL3V1。ORMDL3V1缺失野生型ORMDL3基因的第二外显子，并有不同长度的3’非翻译区(Untranslated Regions, UTR)。编码产生一个与野生型相比氨基端缺失59个氨基酸的截短蛋白质。RT-PCR结果显示与野生型ORMDL3在多种组织和不同细胞系中的广泛表达不同，ORMDL3V1在白细胞、脾脏、胸腺和HeLa细胞中表达高，在肝、结肠、脑、肺脏、肾脏、卵巢和睾丸中低表达，在骨骼肌、心脏、胰腺、前列腺和小肠中、HEK293细胞、成纤维细胞、HL60细胞和子宫内膜细胞未见表达。Western blot分析检测到EGFP-ORMDL3融合蛋白和EGFP-ORMDL3V1融合蛋白的细胞内表达，荧光显微镜观察显示ORMDL3和ORMDL3V1均定位于胞浆。 结论： 人ORMDL3基因的最小活性启动子区域位于-84至+58bp处，Ets-1、p300和CREB能够正向调控ORMDL3的表达；鉴定了一种ORMDL3新剪接异构体，它能在细胞内表达并和野生型ORMDL3一样定位于胞浆。
[Abstract]:Objective:
Cloning of human orosomucoid 1 like protein 3 (orosomucoid1-like protein3 ORMDL3) gene promoter and to find out the minimal active region; identification of key transcription factors regulating ORMDL3 gene; cloning and identification of new ORMDL3 gene splicing isoforms, lay the foundation for clarifying the mechanism of transcriptional regulation.
Method锛

本文编号：1370663