小鼠GSTK1基因启动子调控机制的初步研究
本文关键词：小鼠GSTK1基因启动子调控机制的初步研究 出处：《苏州大学》2012年硕士论文 论文类型：学位论文
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【摘要】：第一部分小鼠GSTK1基因启动子荧光素酶报告基因质粒的构建及功能鉴定 目的： 构建小鼠谷胱甘肽S转移酶K1(mouse Glutathione S-transferase kappa, mGSTK1)启动子荧光素酶报告基因质粒，并分析其活性。 方法： 根据GeneBank中mGSTK1基因序列设计引物，应用PCR技术扩增mGSTK1基因启动子片段（翻译起始点ATG上游-2081～-35区域），插入pGL3-Basic载体，获得mGSTK1启动子报告基因质粒pGL3-mGSTK1-promoter-2046。再以pGL3-mGSTK1-promoter-2046为模板，进一步获得了3个5’端部分缺失的报告基因质粒：pGL3-mGSTK1-promoter-936、pGL3-mGSTK1-promoter-228和pGL3-mGSTK1-promoter-76。利用脂质体将不同长度的mGSTK1启动子驱动的荧光素酶报告基因质粒瞬时转染3T3-L1和HEK293细胞，48小时后检测荧光素酶的活性。 结果： 所构建的质粒经酶切和测序鉴定正确。pGL3-mGSTK1-promoter-2046、 pGL3-mGSTK1-promoter-936和pGL3-mGSTK1-promoter-228在二种细胞株均显示出较强的转录活性，而pGL3-mGSTK1-promoter-76转录活性显著降低。 结论： 成功构建mGSTK1基因启动子荧光素酶报告基因质粒；翻译起始点上游的-263～-111区域是mGSTK1基因启动子的重要区域。 第二部分罗格列酮对3T3-L1脂肪细胞和小鼠脂肪组织GSTK1转录水平的影响 目的： 观察罗格列酮对3T3-L1脂肪细胞以及小鼠脂肪组织中GSTK1转录水平的影响，并分析过氧化物酶增殖体激活受体γ （PPARγ）对报告基因质粒pGL3-mGSTK1-promoter-2046荧光素酶活性的影响。 方法： 1.3T3-L1细胞诱导分化成熟后，，10μM罗格列酮作用24小时后收集细胞，采用实时荧光定量PCR法检测GSTK1和C/EBPα基因mRNA水平的变化。以DMSO处理24小时为对照组。 2.取正常小鼠脂肪组织，10μM罗格列酮作用24小时后收集组织，采用实时荧光定量PCR法检测GSTK1和C/EBPα基因mRNA水平的变化。以DMSO处理24小时为对照组。 3.将pGL3-mGSTK1-promoter-2046与含PPARγ及其配体RXR表达质粒共转染HEK293细胞，48小时后检测报告基因质粒荧光素酶的活性变化。 结果： 1.在诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞中，与对照组相比，罗格列酮组GSTK1mRNA表达水平有上升的趋势（p＞0.05），C/EBPαmRNA表达水平明显增高（p㩳0.05）。 2.在小鼠脂肪组织中，与对照组相比，罗格列酮组GSTK1和C/EBPαmRNA水平均明显上调（p㩳0.05）。 3. PPARγ对pGL3-mGSTK1-promoter-2046的荧光素酶活性没有显著影响。 结论： 1.罗格列酮上调诱导分化成熟后的3T3-L1脂肪细胞以及小鼠脂肪组织中的GSTK1和C/EBPα基因的mRNA水平。 2. GSTK1基因翻译起始位点上游-2081到-35区域可能不存在PPARγ的结合位点；GSTK1mRNA水平的升高可能与C/EBPα增加有关。
[Abstract]:Construction and functional Identification of luciferase reporter Gene plasmid of Mouse GSTK1 Gene Promoter Objective: Mouse Glutathione S-transferase kappa of mouse glutathione S-transferase K1 was constructed. MGSTK1) luciferase reporter gene plasmid and its activity were analyzed. Methods: Primers were designed according to the sequence of mGSTK1 gene in GeneBank. PCR technique was used to amplify the promoter fragment of mGSTK1 gene (ATG upstream of ATG) and inserted into pGL3-Basic vector. The reporter gene plasmid pGL3-mGSTK1-promoter-2046of mGSTK1 promoter was obtained. Then pGL3-mGSTK1-promoter-2046 was used. For the template. Three reporter gene plasmids: pGL3-mGSTK1-promoter-936 were further obtained. PGL3-mGSTK1-promoter-228 and pGL3-mGSTK1-promoter-76. using liposomes to drive mGSTK1 promoters of different lengths. The plasmids of luciferase reporter gene were transiently transfected into 3T3-L1 and HEK293 cells. Luciferase activity was detected 48 hours later. Results: The constructed plasmid was identified by restriction endonuclease digestion and sequencing. PGL3-mGSTK1-promoter-2046 was identified correctly. PGL3-mGSTK1-promoter-936 and pGL3-mGSTK1-promoter-228 showed strong transcriptional activity in both cell lines. However, the transcriptional activity of pGL3-mGSTK1-promoter-76 decreased significantly. Conclusion: The plasmids of luciferase reporter gene of mGSTK1 gene promoter were successfully constructed and the region of -263 ~ (-111) was an important region in the promoter of mGSTK1 gene. Effect of rosiglitazone on GSTK1 transcription in 3T3-L1 adipocytes and adipose tissues of mice Objective: To observe the effect of rosiglitazone on GSTK1 transcription in 3T3-L1 adipocytes and adipose tissues of mice. The effect of peroxidase proliferator activated receptor (纬 -PPAR- 纬) on the luciferase activity of reporter gene plasmid pGL3-mGSTK1-promoter-2046 was analyzed. Methods: After 1. 3T3-L1 cells were differentiated and matured, 10 渭 M rosiglitazone was used for 24 hours to collect the cells. The changes of mRNA levels of GSTK1 and C / EBP 伪 gene were detected by real-time fluorescence quantitative PCR, and the control group was treated with DMSO for 24 hours. 2. 10 渭 M rosiglitazone was taken from the adipose tissue of normal mice for 24 hours, and the tissue was collected after exposure to rosiglitazone for 24 hours. The changes of mRNA levels of GSTK1 and C / EBP 伪 gene were detected by real-time fluorescence quantitative PCR, and the control group was treated with DMSO for 24 hours. 3. PGL3-mGSTK1-promoter-2046 was co-transfected into HEK293 cells with PPAR 纬 and its ligand RXR expression plasmid. The luciferase activity of the reporter plasmid was detected 48 hours later. Results: 1. In 3T3-L1 adipocytes, the expression of GSTK1mRNA in rosiglitazone group was higher than that in control group (p > 0.05). The expression of C / EBP 伪 mRNA was significantly increased. 0.05. 2. In adipose tissue of mice, the levels of GSTK1 and C / EBP 伪 mRNA in rosiglitazone group were significantly up-regulated compared with control group. 0.05. 3. PPAR 纬 had no significant effect on luciferase activity of pGL3-mGSTK1-promoter-2046. Conclusion: 1. Rosiglitazone upregulated the mRNA levels of 3T3-L1 adipocytes and GSTK1 and C / EBP 伪 genes in mouse adipose tissue. 2. There may be no binding sites of PPAR 纬 in the upstream of the translation initiation site of GSTK1 gene from -2081 to -35; The increase of GSTK1mRNA level may be related to the increase of C / EBP 伪.
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363
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