脉冲场凝胶电泳构建非点源污染指示菌E. coliDNA指纹图谱及贝类微生物源示踪研究

发布时间：2018-01-04 11:01

本文关键词：脉冲场凝胶电泳构建非点源污染指示菌E. coliDNA指纹图谱及贝类微生物源示踪研究　出处：《浙江工商大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：海产品因其营养丰富、味道鲜美,一直被人们视为食之上品。而其中又以海贝尤甚,其低脂肪、高蛋白、同时又富含多不饱和脂肪酸和锌等微量元素,被称为“海之珍品”。然而随着沿港规模化畜禽养殖业对环境污染问题的日益突出,农业非点源污染——畜禽废弃物污染已成为近岸海水、滩涂养殖水产品的主要污染源之一,这对于沿岸沿港的滩涂贝类养殖产生了极大的威胁,这是因为贝类是滤食性生物,能够富集养殖环境中的各种污染物,包括病原微生物及其它有毒有害物质。一旦其生长环境遭到污染,作为食物链顶端的消费人群将直接面临疾病的威胁,特别是喜食生鲜贝类的沿海消费人群,在食用这些不洁的贝类后极易引发各种腹痛、呕吐、便血等症状,严重时甚至还会危及生命。因此我们认为十分有必要建立一个系统、有效、科学的贝类产品养殖监管体系来保证这种高价值商品的生产养殖,从而保证消费的安全与可靠。本文拟通过构建不同来源的粪污染指示物大肠埃希氏杆菌(E. coli)的脉冲场凝胶电泳(PFGE)指纹图谱库,探究该方法应用于贝类食品及其养殖环境安全的微生物源示踪(MST),同时为水产品及其相关养殖水体环境监管体系的建立提供理论支撑和科学依据,进而保证水产贝类的安全生产与消费。本课题以东海象山港沿岸滩涂及周边海域为实验海域,经实地考察调研后最终确定象山港区域的西沪港、蟹钳港及大目涂贝类养殖场附近的畜禽养殖场为粪源采样点(已知污染来源的采样点),而将粪源采样点附近(主要以上、中、下游为主)的滩涂贝类养殖场及相关水域列为未知污染来源的采样点,采集得到的各种样品经前期各种选择性培养基(麦康凯琼脂、乳糖胆盐发酵、伊红美蓝琼脂培养基等)的分离纯化得到疑似E. coli菌株,接着通过后期的一系列生化反应鉴定后得到最终的分离株。E. coli DNA的包埋抽提则采用CHEF Genomic DNA Plug Kit试剂盒,提取的基因组DNA经稀有切点限制性内切酶酶切后进行PFGE,电泳图谱结果的聚类分析和Jackknife分析(RCC/RACC)采用Quantity One、InfoQuest?、SPSS等数据分析软件,最后建立东海滩涂已知来源E. coli DNA的PFGE指纹图谱数据库,同时对所建立的指纹图谱数据库进行稳定性评价。此外,将分离自未知来源E. coli(分离自相关的贝样和水样)的DNA也采用PFGE指纹图谱分析,与已知源数据库中的指纹图谱进行比对分析后,同时结合多维尺度分析(ALSCAL),最终判定未知来源E. coli的最可能原始来源,进而探究PFGE这一MST方法应用于贝类食品及其养殖水环境安全溯源的可行性和科学性。采样共采集得到鸭粪、鹅粪、鸡粪和猪粪各40份,总计160份粪便样品；另外在各个港口采集贝类样品各20或40份,总计100份贝样；各个采样点的水样按照上、中、下游分别采集,共采集得到水样60份。粪样经分离后得到鸭源、鹅源、鸡源和猪源的疑似E. coli分离株数分别为112、77、86和98株；经生化鉴定和API20E鉴定后的实际E. coli菌株数分别为91、65、79和83株,得到4种来源的E. coli鉴出率分别为：鸭源E. coli81.25%、鹅源E. coli84.42%、鸡源E. coli91.86%、猪源E. coli84.69%。对PFGE实验方法的优化试验中得出：DNA的包埋量在2.3～5.04*108/ml plugs,即OD600值在1.0-1.4之间,蛋白酶K消化时间选择10hrs,脉冲凝胶电泳参数选择电压梯度6V/cm,电泳角度120°,起始转换时间分别为O.1s和39s,a值为0(线性相关),电泳缓冲液温度14℃,电泳时间21.3hrs,图谱条带分离度与多态性最佳。对指纹图谱传代稳定性评价得出：两株试验菌株(CICC21524和XQ201006SWINE01)在传代15代后,PFGE指纹图谱的最低相似系数均在0.90左右,表明对图谱的稳定性影响不大；指纹图谱的稳定性评价得出：Xba I限制性酶切稳定性也较好,最低相似系数为0.91；脉冲电泳检测的稳定性试验得出连续三次水平脉冲电泳,其差异都很小,这两个试验说明指纹图谱具有良好的稳定性。PFGE指纹图谱库的构建得出：经聚类分析后,PFGE指纹图谱共有69种聚类数,其中包括8种错误聚类数；鸭源、鹅源、鸡源和猪源E. coli的指纹图谱正确判别率(RCC)值分别为91.21%、92.31%、88.61%和92.77%,平均正确判别率(ARCC)值为91.23%；根据上述所建立的已知源指纹图谱库对分离于东海滩涂贝样及相关水域水样的未知来源E. coli菌株进行判别分析,结果得到贝样正确判别菌株26株,溯源鉴出率为29.89%(26/87),水样正确判别菌株为13株,溯源鉴出率为17.57%(13/74)。得到以下结论：1.粪源指示因子E. coli的分离鉴定方法有效可靠,为后续指纹图谱库的建立提供了大量试验素材。2. PFGE指纹图谱具有较好的稳定性,分离得到的E. coli在20代内具有良好的传代稳定性,从而保证图谱库的稳定性。3. PFGE的优化条件具有良好的重复性和可操作性,是后续得到稳定实验结果的可靠保证。4.聚类分析方法结合ALSCAL/MDS分析方法对未知来源的菌株具有较高的正确判别率,这为贝类食品安全微生物源示踪体系的构建提供了可行的方法。
[Abstract]:Because of its rich nutrition and delicious taste , marine products have been regarded as food products . The pollution of agricultural non - point source pollution _ livestock and poultry wastes has become one of the main sources of pollution in coastal waters and tidal flats . In this paper , the samples collected from E . coli isolated from the unknown source were analyzed by means of a series of selective media ( MacConkey agar , lactose bile salt fermentation , eosin methylene blue agar culture medium , etc . ) . The results of the analysis and Jackknife analysis ( RCC / RACC ) were used to determine the most probable origin of E . coli . The samples were collected and collected in 40 parts of duck manure , goose manure , chicken manure and pig manure for a total of 160 parts of stool samples , and 20 or 40 parts of shellfish samples were collected at various ports , and 60 parts of water samples were collected respectively . The results showed that the minimum similarity coefficient of PFGE fingerprint was 0 . 90 % , 92 . 31 % , 88.61 % and 92.77 % , respectively . The following conclusions are obtained : 1 . The isolation and identification method of fecal source indicator E . coli is effective and reliable , which provides a lot of experimental material for the establishment of the subsequent fingerprint library . The PFGE fingerprint has better stability , and the obtained E . coli has good passage stability in 20 generations , thus ensuring the stability of the atlas database . The optimization condition of PFGE has good repeatability and operability . It is a reliable guarantee for the subsequent stable experimental results . 4 . Cluster analysis method combined with ALSCAL / MDS analysis method has high correct judgment rate for the unknown source strains , which provides a feasible method for the construction of the source tracing system of food safety .

【学位授予单位】：浙江工商大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R378

【参考文献】