活性氧对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究

发布时间：2018-01-05 23:19

  本文关键词：活性氧对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究　出处：《天津医科大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目的：建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型及体外大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤模型,利用Annexin V-FITC/PI双染法、免疫组化法、FCM法、MTT法及Western blot法分别检测细胞凋亡、细胞增殖活性、及信号转导子和转录激活子3(STAT3)磷酸化水平,观察活性氧簇(ROS)在缺血再灌注损伤心肌保护机制中的作用,并探讨ROS对心肌细胞中酪氨酸激酶2-信号传导与转录激活因子3(JAK2-STAT3)通路的影响。 方法：1、将32只实验大鼠(体质量240～280g)随机分为4组,每组8只大鼠：(1)空白对照组(Sham组)：开胸后将6/0无损伤缝线穿过左冠状动脉前降支,并不阻断血管。(2)缺血再灌注损伤组(I/R组)：使用6/0无损伤缝线阻断左冠状动脉30min后,开放血管。(3)缺血后处理组(PostC组)：缺血30min后,立即进行缺血后处理(开放10s随后再阻断10s,反复3次)。(4)缺血后处理+MPG组(PostC+MPG组)：再灌注前5min静脉注射自由基清除剂MPG(20mg/kg)。其余处理同缺血后处理组。腹腔注射10%水合氯醛(3mg/g),大鼠四肢接心电图监护电极。分离右侧颈总动脉安置动脉测压管；分离并切开气管,连接小动物呼吸机,气源为室内空气,呼吸频率60次/min,潮气量13～15ml。左侧第4肋间开胸,使用6/0无损伤缝线,穿过左冠状动脉前降支并阻断血管。心电监护显示ST段显著抬高表明冠脉阻断成功。阻断30min后,松开缝线使血管再通,心电监护显示ST段回落。随机选取8只实验大鼠于再灌注10min取心肌标本,用于检测JAK2-STAT3通路活性；随机选取8只实验大鼠于再灌注2h取心肌标本,使用心肌细胞凋亡试剂盒检测心肌细胞凋亡、免疫组织化学法检测心肌组织中bcl-2及bcl-xL蛋白水平、Western blot法检测磷酸化STAT3(p-STAT3)及总STAT3(t-STAT3)水平。2、大鼠心肌细胞(H9C2)经体外培养扩增,使用对数生长期细胞做实验处理。预实验部分分别使用浓度为0、5、10、20、50、100μmol/LH2O2处理H9C2细胞,以确定最佳H2O2预处理浓度。观察低浓度H202预处理对缺氧/复氧所引起细胞损伤的影响。确定最佳预处理浓度后实验部分将细胞分为四组(1)对照组：常规培养。(2)缺氧/复氧组：预先在5%CO2,95%N2培养箱中培养120mmin,复氧30min。(3)H2O2预处理组：预先给予确定浓度的H2O2处理90min换液,24h后重复缺氧/复氧处理。(4) JAK2-STAT3阻断剂(AG490)+H2O2组：在H2O2预处理前10min给予10μmol/L AG490处理,余处理同H2O2预处理组。处理完成后分别使用AnnexinV-FITC/PI双染法及FCM法检测细胞凋亡；MTT法检测H9C2细胞增殖活性；Western blot法检测信号转导子和转录激活子3(STAT3)磷酸化水平。 结果：1、缺血后处理抗凋亡作用：假手术组心肌组织中可见微量bcl-2及bcl-xL蛋白表达,未见明显心肌细胞凋亡；缺血再灌注损伤组bcl-2及bcl-xL蛋白水平均明显升高,可见大量心肌细胞凋亡。缺血后处理显著上调bcl-2(42.4±5.6比8.6±2.4,P0.05)及bcl-xL(19.9±3.2比9.6±2.5,P0.05)蛋白水平,并抑制再灌注后心肌细胞凋亡(37.8±4.0比56.9±6.0,P0.05)。 2、MPG(自由基清除剂)对缺血后处理抗凋亡作用影响：缺血后处理前使用自由基清除剂MPG可使再灌注后心肌组织bcl-2(10.5±2.1比42.4±5.6,P0.05)及bcl-xL(9.9±2.3比19.9±3.2,P0.05)蛋白水平显著降低,并显著升高再灌注后心肌细胞凋亡比率(55.7±7.7比37.8±4.0,P0.05)。 3、MPG对JAK2-STAT3通路影响：缺血后处理显著上调再灌注后STAT3磷酸化水平(0.27±0.02比0.43±0.08,P0.05)。再灌注前使用MPG显著降低缺血后处理后p-STAT3水平(0.27±0.04比0.43±0.08,P0.05),抑制JAK2-STAT3通路活性。 4、不同浓度H2O2预处理对H9C2细胞的影响：与其他各浓度组相比,20μmol/L组的STAT3磷酸化水平显著升高；20μmol/L组与50μmol/L及100μmol/L组相比,心肌细胞凋亡率明显降低(16.63±3.65比37.45±4.82和45.52±4.14,P0.05);20μmol/L组的心肌细胞活力及细胞凋亡率与5及10μmol/L组差异无统计学意义。 5、20μmol/L H2O2预处理对心肌细胞凋亡率、细胞活力及对STAT3磷酸化水平的影响：缺氧/复氧组较对照组凋亡率明显升高,差异有统计学意(47.71±4.74比6.22±1.72,P0.01)；H2O2预处理组凋亡率较缺氧/复氧组明显降低,差异有统计学意义(27.25±3.06比47.71±4.74,P0.01)；缺氧/复氧组和AG490组之间细胞凋亡率差异无统计学意义。缺氧/复氧组和AG490+H2O2组心肌细胞活力较对照组明显降低,差异有统计学意义(P0.01)；H2O2预处理组心肌细胞活力较缺氧/复氧组明显升高,差异有统计学意义(76.51±4.36比46.32±5.62,P0.01)。结果显示H2O2预处理可显著增高STAT3磷酸化水平；AG490+H2O2组的STAT3磷酸化水平明显低于单纯H2O2预处理组。 结论：1、氧化还原信号通路在缺血后处理抗心肌细胞凋亡机制中发挥重要作用。在缺血后处理机制中,ROS可能通过激活JAK2-STAT3通路并进一步上调bcl-2及bcl-xL等凋亡蛋白水平,发挥抗心肌细胞凋亡作用。 2,20μmol/LH2O2预处理可以显著激活再灌注后JAK2-STAT3通路,并对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤具有的适应性保护作用。
[Abstract]:Objective: to establish a rat model of myocardial ischemia reperfusion injury model in rat myocardial cells and hypoxia / reoxygenation injury model, using Annexin V-FITC/PI double staining, immunohistochemical method, FCM method, were used to detect the apoptosis of MTT method and Western blot method, cell proliferation, and signal transduction and activators of transcription 3 (STAT3) phosphorylation, observation of reactive oxygen species (ROS) in the mechanism of myocardial protective effect of ischemia reperfusion injury, and the effect of ROS on myocardial cells in the tyrosine kinase 2- signal transducer and activator of transcription 3 (JAK2-STAT3) pathway.
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本文编号：1385293