盐酸小檗碱通过SortaseA和Esp途径影响粪肠球菌生物被膜的初步探讨

发布时间：2018-01-06 23:35

  本文关键词：盐酸小檗碱通过SortaseA和Esp途径影响粪肠球菌生物被膜的初步探讨　出处：《中南大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：1.粪肠球菌生物被膜形成的动态观察及早期相关基因的表达研究 目的：建立粪肠球菌生物被膜(biofilm, BF)体外模型,观察生物被膜形成发展过程中空间立体结构上的动态变化；探讨sortaseA (转肽酶A编码基因)基因、esp(肠球菌表面蛋白)与粪肠球菌生物被膜形成早期的相关性,以利于临床寻找药物靶点,提高用药效率。 方法： (1)临床筛选并鉴定尿路感染相关性粪肠球菌生物被膜菌,分为生物被膜菌组及生物被膜阴性组,结晶紫染色法定量检测生物被膜量。 (2)采用玻片法体外建立粪肠球菌生物被膜模型,分别培养1、8、16、24、48及72h,利用激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)及荧光显微镜动态观察生物被膜形成发展过程中的空间结构变化。 (3)利用实时定量PCR方法相对定量检测esp、 sortaseA在生物被膜早期菌和生物被膜阴性菌中的表达差异,做统计学分析。 结果： (1)本院99例尿路感染患者导尿管中共筛选出生物被膜菌36株,阳性率36.4%。其中粪肠球菌占生物被膜菌的27.8%。 (2)结晶紫染色定量显示菌株在1、8、16h生物被膜逐渐形成,24h趋于顶峰,随后生物被膜量回落,48h有减少,72h进一步减少。 (3)菌株培养在16小时基本形成,24小时成熟,48小时有播散。随着生物被膜形成过程的进展,死菌量及活菌量逐渐增多,到48h开始有所减少；细菌总量由粘附面到游离面逐渐减少；中间层活菌量密度最高。 (4) sortaseA、 esp基因的表达与粪肠球生物被膜菌形成早期具有相关性。生物被膜早期菌组sortaseA、 esp表达量分别是生物被膜阴性菌组的7.9与13.5倍。 小结： (1)本研究细菌尿路感染中,生物被膜菌检出率为36.3%.其中以粪肠球菌所占生物被膜菌比例最大(27.8%)。这一结果与我们实验室三年前研究的结论基本一致,提示本院在近三年留置导尿管相关的尿路感染生物被膜菌分布变化不明显。 (2)利用荧光显微镜及CLSM观察,证实了粪肠球菌BF形成和发展经历了最初的定植及不可逆黏附等早期阶段、结构分化阶段、发展成熟阶段、和解聚再定植阶段。细菌总量由粘附面到游离面逐渐减少；中间层活菌量密度较高。 (3)sortaseA、 esp基因与粪肠球生物被膜菌形成早期密切相关,在生物被膜形成早期上调。 2.盐酸小檗碱对粪肠球菌生物被膜形成的影响 目的：研究盐酸小檗碱对粪肠球菌生物被膜形成的影响,并探讨其作用机制。 方法：以生物被膜量较强的菌株EF06为研究对象,将盐酸小檗碱处理菌株EF06的不同分为两组,甲组为不同浓度盐酸小檗碱与EF06共同孵育24h；乙组为EF06培养24h后与不同浓度盐酸小檗碱再共培24h。荧光显微镜观察药物未处理组和处理组之间的差异。结晶紫染色法定量检测不同处理组内生物被膜形成量和生物被膜量的差异,做统计学分析。 结果： (1)荧光显微镜检测,甲处理组中盐酸小檗碱作用浓度在20μg/ml和40μg/ml时,EF06细菌密度略高于药物未处理组,但随着药物浓度的增加,细菌密度逐渐减少。乙处理组盐酸小檗碱作用浓度在200,400和600μg/ml时,生物被膜结构上未见明显的变化,当达到800μg/ml时生物被膜厚度有所减少,达到1000瞻/ml,生物被膜厚度减少明显。 (2)结晶紫染色定量测得OD600值。在甲组,药物浓度为20、40μg/ml与0μg/ml比较,p0.05；药物浓度60、80和100μg/ml与0μg/ml比较,p0.05；药物浓度60、80与100μg/ml之间两两比较,p0.05,前者大于后者。在乙组,药物浓度为200、400及600μg/ml与0μg/ml比较,p0.05,药物浓度800和1000μg/ml与0μg/ml比较,p0.05,药物浓度800与1000μg/ml比较,p0.05,前者大于后者。 小结： (1)盐酸小檗碱对粪肠球菌生物被膜的形成有抑制作用,药物浓度达到60μg/ml后,其抑制作用与药物作用浓度成正相关。 (2)盐酸小檗碱降低粪肠球菌生物被膜量,浓度从800μg/ml开始,随着浓度增加,生物被膜量逐渐减少。
[Abstract]:Study on the dynamic observation of biofilm formation of 1. Enterococcus faecalis and the expression of early related genes
Objective: to establish the Enterococcus faecalis biofilm (biofilm, BF) in vitro model, observe bio dynamic changes of space in the process of the development of three-dimensional structure of film forming; sortaseA (GGT gene encoding A gene (ESP), enterococcal surface protein) and Enterococcus faecalis biofilm formation in early correlation to clinical searching for drug targets, improve administration efficiency.
Method锛，

本文编号：1390035