氧化应激对内皮祖细胞作用的蛋白质组学分析

发布时间：2018-01-07 00:15

本文关键词：氧化应激对内皮祖细胞作用的蛋白质组学分析　出处：《吉林大学》2012年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：内皮祖细胞（endothelial progenitor cells, EPCs）可分化为内皮细胞，在组织损伤或者缺血时可被募集到损伤部位参与新生血管形成，以此来修复受损组织。目前的研究显示在有高脂血症、高血压、糖尿病、心脏病或者吸烟的脑血管病高危人群中，外周血EPCs数量降低、功能减退。它不仅是脑卒中的风险及预后预测指标，更因其能修复血管内皮、生成新生血管、延缓动脉粥样硬化斑块形成、促进神经发生而成为对于急性缺血性脑卒中患者具有治疗潜力的一类细胞。活性氧（reactive oxygen species, ROS）是需氧细胞在代谢过程中产生的，包括超氧阴离子（Ο2）、过氧化氢（H2O2）、超氧化氢离子（ΗΟ2）和羟自由基（ΟΗ）。许多病理条件例如高脂血症、高血压病、糖尿病会增加血管壁ROS的产生。另外，急性组织缺血也会导致微环境中ROS产生增多。目前的研究显示EPCs可通过高表达抗氧化酶类来对抗、防御氧化应激损伤，已被证实的抗氧化酶包括过氧化氢酶、锰超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，MnSOD）和谷胱甘肽过氧化物酶1（glutathione peroxidase-1，，GPx-1）、血红素加氧酶1（haemoxygensae1，HO-1）。但是研究显示在同样的条件下,联合抑制EPCs前3种抗氧化酶后产生的ROS水平仍然较人脐静脉内皮细胞（human umbilicalvein endothelial cells，HUVECs）低,提示还有另外的抗氧化酶在EPCs中发挥清除ROS的作用。对于氧化损伤机制目前已知的有氧化应激使凋亡信号调控激酶1（apoptosis signal-regulating kinase1，ASK1）活性增高，导致细胞凋亡并由此引起血管形成能力降低。另外细胞内ROS产生的增多使人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）活性降低，EPCs血管生成能力降低，同时增加的ROS刺激TERT从细胞核输出到细胞浆，导致端粒复制能力降低、延长能力丧失，端粒缩短，最终使细胞老化。其他有关氧化损伤机制的研究大多涉及高糖环境、氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）、血管紧张素II（angiotensin II，Ang II）等因素导致的ROS升高，并且从这些因素本身对EPCs的影响来推测ROS对EPCs的作用，而对ROS与EPCs功能状态的直接作用机制了解甚少。本研究旨在通过蛋白质组学技术为EPCs的抗氧化机制和氧化损伤机制的研究寻找新的线索。本研究应用MTT比色法、划痕实验和小管形成实验对不同浓度（100、200、300和400μM）H2O2对EPCs作用3小时后的细胞数量、迁移能力和小管形成能力进行了比较，发现与对照组相比，细胞数量减少、迁移和小管形成能力下降，且这种负性作用为剂量依赖性。应用二维差异凝胶电泳（two-dimensional differential in-gelelectrophoresis，2D-DIGE）结合基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱（matrix-assistedlaser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI TOF/TOF MS）鉴定的方法对200μM H2O2处理3小时后的EPCs氧化应激模型进行了蛋白质组的分离和鉴定，发现了8个有明显表达差异的蛋白质，其中6个表达上调，2个表达下调。应用2D-Western blot方法选取其中一个蛋白进行验证，证明了质谱鉴定结果的正确性。EPCs通过高表达抗氧化蛋白过氧化还原酶2（peroxiredoxin-2，Prx-2）、硫氧还蛋白依赖性过氧化物还原酶即过氧化还原酶3（thioredoxin-dependent peroxide reductase/peroxiredoxin-3，Prx-3）、过氧化还原酶6（peroxiredoxin-6，Prx-6）和细胞骨架蛋白包含表皮生长因子腓骨蛋白样细胞外基质蛋白1（EGF-containing fibulin-like extracelluarmatrix protein1，EFEMP1）、波形蛋白（vimentin）来防御氧化应激损伤。对于氧化损伤的机制，我们的研究发现抑制信号转导的Rab GDP分离抑制剂α（Rab GDPdissociation inhibitor alpha，Rab GDI α）表达上调，参与清除氧化核苷酸、减少DNA复制错误的ADP糖焦磷酸酶（ADP-sugar pyrophosphatase，NUDT5）和催化“有氧糖酵解”产生能量的磷酸丙糖异构酶（triosephosphate isomerase，TIM）表达均下调。可见，尽管存在防御反应（包括抗氧化蛋白和细胞骨架蛋白的表达上调），由于与信号转导、氧化核苷酸清除、能量产生相关蛋白的表达改变，EPCs仍表现出数量减少、迁移和小管形成能力下降。这一发现提示我们今后在研究保护EPCs免受氧化应激损伤的关键点的工作中，不能仅仅关注于防御反应蛋白，更要重视像Rab GDIα、NUDT5和TIM这样的蛋白。因为这些负性通路不能被防御反应所保护，也许正是氧化应激造成EPCs功能紊乱的关键通路。本研究采用2D-DIGE结合MALDI TOF/TOF MS鉴定的方法研究EPCs氧化应激模型的蛋白质组学改变，这在国内外均未见报道，所鉴定的8个差异表达蛋白在EPCs氧化应激的研究中也均未见报道。抗氧化蛋白和细胞骨架蛋白表达上调的发现使EPCs抗氧化机制的研究得到进一步完善，而与信号转导、氧化核苷酸清除、能量产生相关蛋白的表达改变的发现为EPCs氧化损伤机制的研究提供了新的线索。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

【参考文献】