自体骨髓基质细胞组织工程化神经修复猕猴正中神经50mm缺损的实验研究

发布时间：2018-01-10 19:33

本文关键词：自体骨髓基质细胞组织工程化神经修复猕猴正中神经50mm缺损的实验研究　出处：《苏州大学》2011年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的: 探讨猕猴骨髓基质细胞(rhesus monkey bone marrow stromal cells, RhBMCSs)的生物学特性以及其与支架材料聚乳酸乙醇酸(poly lactide-co-glycolide acid,PLGA)在体外的生物相容性,并观察自体RhBMCSs作为种子细胞与壳聚糖导管和PLGA纤维支架构建的组织工程化神经移植修复猕猴周围神经长距离缺损的能力及其安全性,为该组织工程化神经的临床应用提供实验依据。方法: 1、应用贴壁培养法从成年猕猴骨髓中分离RhBMCSs,检测细胞表面抗原、细胞周期、生长增殖能力及分化能力。 2、将第二代RhBMCSs与PLGA支架材料联合培养,通过共焦显微镜和扫描电镜观察细胞形态,应用MTT法检测RhBMCSs活性,应用流式细胞术检测细胞周期,应用实时荧光PCR和Western Blot检测RhBMCSs神经营养因子的分泌情况。 3、建立猕猴正中神经50mm缺损模型并随机分为4组(每组3只):细胞组用由壳聚糖导管及置入其中的PLGA支架组成的神经移植物桥接缺损神经并注入自体RhBMCSs;材料组仅以神经移植物桥接而不加细胞;自体组用自体神经原位移植;缺损组不予任何桥接。术后3、6、9、12个月分别对各组动物术肢大鱼际肌及对指功能等情况进行拍照、摄像记录。术后12个月,进行神经电生理和荧光金逆行示踪检测;运用光镜和电镜组织学方法对再生神经和靶肌肉进行形态学观察及免疫荧光化学检测,利用图像分析系统进行形态计量分析。术前及术后3、6、9、12个月对所有动物抽取外周血液进行血液常规、生化和凝血功能检查,并且于术后12个月时行免疫功能指标、肿瘤标志物检测及重要脏器组织病理学检查。结果: 1、RhBMCSs呈梭形、成纤维细胞样,表达CD73、CD105、CD29和CD90,而不表达CD34、CD45和CD11b,第二代RhBMSCs G0/G1期、S期和G2期所占的百分比分别为83.36%、12.71%和3.93%,符合基质干细胞的特性。 2、RhBMCSs与PLGA共培养24h后,可见部分细胞呈球形或短梭形贴附与纤维支架表面,此后细胞沿PLGA纤维延伸,逐渐转为长梭形,激光共焦显微镜下可见CD29阳性的BMSCs黏附包绕在PLGA纤维表面,形成长长的细胞链。扫描电镜下可见BMSCs与PLGA贴附良好,且有较多细长的突起从BMSCs伸出,沿着材料伸展。RhBMCSs在PLGA浸出液中培养至7天,其形态和细胞活力与普通培养基组相比无明显差异(P0.05)。两组间细胞增殖指数(G2M + S)/G0G1 + G2M+S)亦无差异(P0.05)。在PLGA浸出液中培养72h后,猕猴BMSCs神经营养因子(NGF、BDNF,CNTF及bFGF) mRNA表达量及蛋白表达量与普通培养基中生长的BMSCs相比没有显著差异(P0.05)。 3、神经移植术后动态地观察猕猴术侧手臂使用频率、拇指力量及手指运动功能,细胞组、材料组和自体神经组呈渐进性恢复,12个月时,细胞组及自体神经组动物手指灵活,拇指与食指对指功能优于材料组,缺损组动物拇指外展困难,对指功能丧失,大鱼际肌逐渐萎缩。术后12个月神经电生理学检测示材料组、细胞组、自体神经组再生正中神经远侧端复合肌动作电位(CMAP)平均波幅分别为:4.63±0.13mV,4.45±0.49 mV,8.89±2.85 mV,材料组及细胞组与自体组比较有统计学差异(P0.05);近侧端CMAP平均波幅分别为:3.63±1.14mV,3.82±0.41 mV,6.50±2.51 mV,三组间无统计学差异(P0.05);平均运动神经传导速度分别为:12.87±2.14 m/s、18.59±4.87 m/s、30.21±2.90 m/s,三组间无统计学差异(P0.05)。荧光金(FG)逆行示踪检查示材料组、细胞组、自体神经组术侧相应节段脊髓灰质前角运动神经元中FG阳性细胞数分别为15292±1005、15814±600和16000±841,三组间无统计学差异(P0.05);相应背根神经节感觉神经元中FG标记率分别为76.14%±7.62%、79.61%±6.60%和82.79%±5.11%,细胞组与自体神经组无统计学差异,但导管组FG标记率低于细胞组和自体神经组(P0.05)。术后12个月,材料组和细胞组移植部位壳聚糖导管和PLGA纤维支架已完全降解,再生组织连接了正中神经50mm缺损。神经三色染色和抗NF200、S-100免疫荧光化学染色结果显示,材料组、细胞组、自体神经组再生神经纤维从近侧端穿越桥接段,长入了远侧神经干,细胞组桥接物段再生神经纤维密集,好于材料组,缺损组未见再生神经结构。透射电镜下,材料组、细胞组、自体神经组再生神经远段神经横切面神经髓鞘厚度分别为:0.63±0.27μm、0.82±0.39μm、1.11±0.58μm,各组之间均有统计学差异(P 0.05);有髓神经直径分别为:4.09±1.12μm、4.59±1.39μm、5.57±2.13μm,各组之间比较均有统计学差异(P 0.05),缺损组神经变性萎缩明显,几乎看不到正常神经结构。大鱼际肌Masson三色染色后可见细胞组和自体神经组肌纤维比较饱满,肌束之间可见少量胶原纤维增生,材料组肌束之间见较多胶原纤维增生;缺损组大鱼际肌表现为明显的失神经萎缩,胶原纤维、结缔组织和脂肪组织大量增生。材料组、细胞组、自体神经组大鱼际肌肌纤维平均横截面积分别为: 658.84±420.84μm~2、696.80±357.60μm~2、1232.54±335.79μm2,材料组和细胞组与自体神经组比较差异均有统计学意义( P 0.05 )。材料组、细胞组、自体神经组大鱼际肌胶原纤维面积平均百分比分别为: 29.62±10.01%、23.04±8.77%、22.65±6.41%,材料组与自体神经组比较差异有统计学差异( P 0.05 ),细胞组与自体神经组比较差异无统计学意义( P 0.05 )。术后各组猕猴血常规、血电解质、肝功能、肾功能、心酶谱、血糖、血脂及凝血功能检查,结果均在正常范围,与术前相比及各组间相比均无统计学差异。术后12个月检测免疫功能指标,各组间结果无统计学差异,术后12个月行肿瘤标志物检测,所有动物均未见异常。术后12个月行心、肝、肺、肾、脾及淋巴结组织病理学检查,各脏器未见病理学改变。结论: 1、应用贴壁培养法所得RhBMSCs在第2-3代时形态均一,增殖旺盛,其生物学特性符合干细胞特征,可以用于构建组织工程化神经移植物。 2、RhBMSCs能在PLGA支架上贴附生长,未见PLGA对细胞活力、分裂增殖能力及神经营养因子分泌的不良影响,表明RhBMSCs与PLGA支架材料有良好的生物相容性。 3、由自体骨髓基质细胞、壳聚糖导管和聚乳酸乙醇酸纤维支架构建的组织工程化神经桥接猕猴50mm正中神经缺损,术后12个月再生神经修复了缺损,恢复了神经干的连续性,再生神经在形态结构和生理功能上都得到了恢复,并实现了靶肌的神经再支配,猕猴术肢的运动功能得到了改善。 4、血液检查及重要脏器组织病理学检查表明该组织工程化神经应用于灵长类动物猕猴体内是安全的。本研究结果为临床应用自体骨髓基质细胞组织工程化神经修复周围神经损伤提供了实验依据,具有指导意义。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R329

【参考文献】