家蝇蛹凝集素的分离纯化及对鼠腹腔巨噬细胞免疫功能的影响

发布时间：2018-01-10 23:33

  本文关键词：家蝇蛹凝集素的分离纯化及对鼠腹腔巨噬细胞免疫功能的影响　出处：《天津科技大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：家蝇独特的免疫防御机制一直是国内外研究的热点问题之一,因此,对家蝇免疫活性的研究具有重要的意义。本文在前期研究的基础上,通过Con A Sepharose4B亲和层析、DEAE弱阴离子交换层析、超滤冻干等方法从家蝇蛹中分离纯化出一种新型的家蝇蛹凝集素。通过凝血活性及鼠腹腔巨噬细胞增殖实验筛选出最佳组分MBL-1。SDS-PAGE电泳及高效液相色谱证明其为单一蛋白,分子量约为24kDa。 研究结果表明MBL-1蛋白含量为97.2%,糖含量为2.55%,且希夫试剂糖染色实验证实其含有糖链结构。MBL-1对兔血红细胞的凝集效价为256,其凝血活性在0-40℃和pH6.0-9.0范围内保持相对稳定,活性可被D-甘露糖和D-葡萄糖所抑制。同时,通过β-消除反应、红外光谱、原子力显微镜和蛋白N端测序仪对MBL-1的结构进行了初步探讨,证明了MBL-1是一种存在N-糖苷键,直径60-100nm的椭球状蛋白单体,肽链N-端封闭。经串联质谱分析MBL-1的肽段序列与来源为家蝇的谷胱甘肽硫转移酶1(GST-θ)具有较高的相似性。 MTT实验表明MBL-1可促进巨噬细胞增殖,且具有浓度依赖关系,最佳作用浓度为40μg/mL,最佳作用时间为48h。中性红吞噬实验结果表明MBL-1可以增强巨噬细胞的吞噬活性,此外,在一定范围内MBL-1能够增加巨噬细胞NO的表达量。扫描电镜结果显示MBL-1还具有激活巨噬细胞的作用。MBL-1对巨噬细胞细胞因子IL-6、IL-12、TNF-α的分泌有影响。Western blot结果表明MBL-1激活了鼠腹腔巨噬细胞的ERK通路,促进了巨噬细胞的增殖,ERK通路对巨噬细胞细胞因子IL-6、IL-12、 TNF-α的产生也有所影响。综上所述,家蝇蛹凝集素对鼠腹腔巨噬细胞具有明显的免疫调节活性,为天然免疫增强剂的开发应用提供了一定的理论参考依据,具有重要意义。
[Abstract]:The unique immune defense mechanism of Musca domestica has been one of the hot issues at home and abroad, so it is of great significance to study the immune activity of housefly. The weak anion exchange chromatography was performed by Con A Sepharose4B affinity chromatography. A new type of agglutinin was isolated and purified from the pupae of housefly by ultrafiltration freeze-drying method. The best component MBL-1.SDS-PAGE electrophoresis was screened by coagulation activity and peritoneal macrophage proliferation test. And high performance liquid chromatography (HPLC) showed that it was a single protein. The molecular weight is about 24 kDa. The results showed that the content of MBL-1 protein and sugar was 97.2and 2.55% respectively. The agglutination titer of rabbit red blood cells was 256 by Schiff reagent sugar staining. Its clotting activity remained relatively stable in the range of 0-40 鈩，

本文编号：1407276