分泌型IgA嵌合抗体在中国仓鼠细胞中的表达研究

发布时间：2018-01-11 23:06

  本文关键词：分泌型IgA嵌合抗体在中国仓鼠细胞中的表达研究　出处：《陕西师范大学》2011年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：分泌型ⅠgA(SIgA)是人体粘膜表面的主要抗体,是抵御病原体侵袭的第一道免疫防线。目前为止尚没有人尝试在动物呼吸道或消化道使用分泌型IgA阻断H5N1病毒的感染。由于禽流感主要是通过呼吸道或消化道感染,因此,呼吸道SIgA或消化道SIgA在病毒感染的最早期阶段产生最有效的保护效果。本次研究选择在中国仓鼠的卵巢(chinese hamster ovary, CHO)细胞中表达嵌合SIgA抗体,此嵌和抗体是抗H5N1病毒的具有中和活性的抗体,并且尝试了研究预防性分泌型IgA类抗体。 从分泌抗禽流感的H5N1-HA单克隆抗体的杂交瘤细胞HA8中提取总RNA,应用RT-PCR方法对轻链可变区基因和重链可变区基因进行扩增,将PCR产物克隆到pMD18-T载体上,进行基因测序并且进行基因序列的分析,经过分析,此抗体为小鼠的免疫球蛋白基因,轻链可变区共有393个碱基, V段为IgKVⅢ家族,J段为IgKJ I家族,重链可变区共有414个碱基,其中,重链可变区属于IgHVⅠ家族,J段来自IgHVⅡ家族,D段来自IgHVⅣ家族；通过重叠延伸PCR技术,将鼠源重链可变区基因与人的IGHA2基因进行拼接,鼠的轻链可变区基因与人的CK进行连接,成功构建完成了人／鼠嵌合IgA抗体的基因。将人／鼠嵌合IgA抗体轻、重链基因分别克隆到表达载体pEF-dhfr-Neo载体中,此载体是以新霉素抗性基因(NEO)和二氢叶酸还原酶基因(DHFR)两者为双筛选标记,以CMV早期启动子引导的。 用已经成功构建的表达质粒pEF-IGK8和pEF-IGHA8转染CHO/dhfr-细胞,经过选择性培养基(无次黄嘌呤、胸腺嘧啶的DMEM)进行筛选,然后挑取阳性克隆,利用MTX加压的方法,进一步加压来提高表达量。然后对经过加压的细胞株扩大培养,然后纯化抗H5N1病毒的嵌合IgA抗体,用亲和层析柱(具有专一性结合人源抗体Kappa链的蛋白)从含有牛血清CHO细胞的培养上清中进行纯化嵌合IgA抗体,并对其免疫学特性进行了分析。最后,将构建完成的表达质粒pEF-IGHA8,pEF-IGK8瞬时共转染CHO/dhfr-细胞,经过培养48-72小时,细胞上清使用ELISA方法对SIgA抗体各组分的分泌情况进行检测。 总之,本研究成功且完整的克隆了抗H5N1病毒的中和性单抗可变区基因,并且对其可变区基因的序列进行了胚系基因片段的分析；成功构建了完整人-鼠嵌合IgA抗体的基因；成功的构建了重组SIgA的相关的基因的表达载体；最后,通过对CHO细胞的转染,初步得到了嵌合的IgA抗体和SIgA抗体。
[Abstract]:Secretory type 鈪，

本文编号：1411610