广州管圆线虫半乳糖凝集素-1基因的克

发布时间：2018-01-12 08:21

  本文关键词：广州管圆线虫半乳糖凝集素-1基因的克隆、表达和凝集反应　出处：《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》2017年01期 　论文类型：期刊论文

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【摘要】：目的克隆、表达广州管圆线虫(Angiostrongylus cantonensis)半乳糖凝集素-1(galectin-1)基因并分析其凝集反应。方法用Swiss Model分析galectin-1的三维结构。提取广州管圆线虫雌性成虫总RNA,根据galectin-1基因编码序列(Gen Bank登录号为JN133961.1)设计引物,RT-PCR扩增目的基因,亚克隆至p ColdⅢ质粒,转化大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21,取重组质粒进行双酶切、PCR鉴定和测序。阳性质粒经0.1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,镍柱亲和层析法纯化galectin-1重组表达蛋白后,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白表达情况。以广州管圆线虫全虫免疫的小鼠血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)验证目的蛋白。将重组蛋白10倍稀释为5.55×10~(-1)~5.55×10~(-5)ng/μl,显微镜观察其与新鲜的ICR小鼠血液中红细胞的凝集反应。结果 Swiss Model分析结果显示,galectin-1以非二聚体形式发挥作用。galectin-1基因RT-PCR扩增产物约为850 bp,与预期结果一致。经双酶切、PCR和测序结果显示,重组质粒p ColdⅢ-galectin-1构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量约36 000的可溶性重组融合蛋白。Western blotting分析结果显示,galectin-1蛋白能被全虫免疫的小鼠血清识别。凝集反应结果显示,galectin-1蛋白与小鼠红细胞发生明显凝集反应的最低浓度为5.55×10~(-4)ng/μl。结论克隆的galectin-1基因能在p ColdⅢ原核表达系统中呈可溶性表达,并与小鼠红细胞发生凝集反应。
[Abstract]:Objective cloning. Expression of galactose agglutinin-1 galectin-1 (Angiostrongylus cantonensis). Methods the three-dimensional structure of galectin-1 was analyzed by Swiss Model. The total RNA of female adult of Angiostrongylus cantonensis was extracted. Primers were designed to amplify the target gene by RT-PCR according to the galectin-1 gene encoding sequence Gen Bank accession number is JN133961.1). The recombinant plasmid was subcloned into p Cold 鈪，

本文编号：1413450