P38促分裂素原活化蛋白激酶在重铬酸钾诱导A549细胞凋亡中的作用

发布时间：2018-01-14 10:25

  本文关键词：P38促分裂素原活化蛋白激酶在重铬酸钾诱导A549细胞凋亡中的作用　出处：《郑州大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：铬(Cr)作为一种常见的化学元素,化合价态为-2到+6,其中以+3和+6价态最为常见。三价铬在有效剂量下是无毒的,是人和动物必需的营养素。六价铬是一种剧毒剂,具有致癌性、致突变性、致畸性、免疫毒性、生殖毒性、神经毒性,是一种重金属环境污染物。 六价铬广泛存在于香烟烟雾、汽车尾气和生活环境等,主要用于电镀行业、制革行业、化学工业、染料行业、冶金行业,还有不锈钢焊接和木材加工行业等。六价铬能够被细胞内的还原系统还原,进而产生大量的低价态铬离子,低价态铬离子容易与DNA结合产生DNA加合物；铬被还原过程中,会产生大量的活性氧,然后诱导细胞的氧化应激反应,进而导致细胞DNA直接损伤以及细胞修复系统的远期损伤,同时活性氧对细胞的刺激产生一系列的信号传导级联反应。有实验证明六价铬能够影响细胞凋亡信号传导通路。 P38MAPK能够被各种生长因子、炎性细胞因子以及各种物理化学刺激因素激活,激活后的P38激酶能够调节细胞的生长、分化、凋亡,进而影响其下游通路。半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3在细胞凋亡中起着重要作用,在Caspase蛋白酶级联切割过程中起核心因子作用。近年来P38-MAPK和Caspase-3是介导细胞增殖和凋亡等热点问题的重要因子。 目的： 基于上述分析,该研究通过建立体外细胞模型,培养人肺癌上皮细胞(A549细胞),然后使其暴露于不同浓度的重铬酸钾染毒液中,观察各分组凋亡率水平,并且从蛋白表达水平上分析重铬酸钾对A549细胞激活的磷酸化P38、总P38和Caspase-3等相关凋亡蛋白的表达水平,进而探讨重铬酸钾诱导A549细胞凋亡机制,为进一步了解重铬酸钾诱导肺癌机制提供理论依据。 方法： 1.首先建立A549细胞的体外细胞模型。 2.利用MTT比色法来测定0μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L的重铬酸钾对A549细胞生长的影响,并且确定合适的染毒浓度。 3.用流式细胞仪检测重铬酸钾对A549细胞凋亡的影响,观察加入P38抑制剂后染毒组细胞凋亡率和抑制剂组细胞凋亡率的表达水平。 4. Western blot法检测重铬酸钾染毒后P-P38、P38和Caspase-3的蛋白表达水平。 5.统计分析。运用SPSS12.0统计软件,数据用x±s表示,采用t检验、单因素方差分析(analysis of variance,ANOVA)对数据进行统计分析(检验水准a=0.05)。 结果： 1.MTT结果：染毒浓度为40μmol/L时,A549细胞的增殖抑制率为76.25%。根据细胞染毒后的细胞活性不同,确定了IC50=7.6μmol/L,选用染毒浓度为0μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L进行下一步实验。 2.流式细胞仪检测细胞凋亡结果为：当重铬酸钾染毒浓度是0μmol/L的时候,正常染毒组A组和加抑制剂染毒组B组相比升高,差异无统计学意义(P0.05)；当重铬酸钾染毒浓度是2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L的时候,正常染毒组A组和加抑制剂染毒组B组相比下降,差异有统计学意义(P0.05) 3. Westblot实验检测蛋白表达：重铬酸钾正常染毒组的P-P38蛋白和Caspase-3蛋白相对表达量分别比起加抑制剂重铬酸钾组的P-P38蛋白和Caspase-3蛋白相对表达量升高,差异有统计学意义(P0.001)；各分组细胞的P38总蛋白在不同刺激下差异没有统计学意义(P0.05)。 结论： 重铬酸钾能诱导A549细胞凋亡,呈剂量反应关系；P38信号传导通路在重铬酸钾致A549细胞凋亡中起促进作用；SB203580能抑制P38信号传导通路,对A549细胞凋亡其保护作用。
[Abstract]:Chromium (Cr) as a common chemical element, the valence of -2 to +6, in which +3 and +6 are the most common valence. Trivalent chromium is non-toxic in the effective dose, are essential nutrients for human and animal. Six chromium is a toxic agent, has carcinogenicity, mutagenicity, teratogenicity, immunotoxicity, reproductive toxicity, neurotoxicity, is a kind of heavy metal pollutants.
Six chromium exists widely in cigarette smoke, car exhaust and living environment, mainly used in electroplating industry, leather industry, chemical industry, dyestuff industry, metallurgical industry, and the welding of stainless steel and wood processing industries. Six chromium can restore the system to restore the cells, which produce large amounts of low valence chromium ions, low price chromium ions easily combined with DNA to produce DNA adducts; chromium reduction process, will produce large amounts of reactive oxygen species, and then induced cellular oxidative stress response, causing long-term damage cell DNA damage and cell repair system, and stimulate the active oxygen to the cells produce a series of signal transduction cascade reaction. Experiments have proved that six chromium can affect apoptosis signaling pathways.
P38MAPK can be a variety of growth factors, activation of inflammatory cytokines and various physical and chemical stimuli, after activation of P38 kinase can regulate cell growth, differentiation, apoptosis, thereby affecting the downstream pathway. Cysteine aspartic acid protease -3 in cell apoptosis plays an important role, played a key role in the Caspase factor protease cascade in the cutting process. In recent years, P38-MAPK and Caspase-3 is an important factor mediated cell proliferation and apoptosis and other hot issues.
Objective:
Based on the above analysis, this research established a cell model in vitro, cultured human lung epithelial cells (A549 cells), which is then exposed to potassium dichromate exposure to different concentrations of liquid, observe the apoptosis rate of each group, and from the protein expression of phosphorylated P38 potassium dichromate on A549 cell activation level, the expression level of P38 and total Caspase-3 protein related to apoptosis, and to explore the mechanism of A549 cell apoptosis induced by potassium dichromate, in order to further understand the mechanism of lung cancer induced by potassium dichromate and provide a theoretical basis.
Method锛，

本文编号：1423183