结核分枝杆菌CFP10-PPE68融合蛋白表达及其在结核病诊断中的初步应用

发布时间：2018-01-14 16:14

  本文关键词：结核分枝杆菌CFP10-PPE68融合蛋白表达及其在结核病诊断中的初步应用　出处：《重庆医科大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目的： 构建结核分枝杆菌CFP10-PPE68融合基因原核表达质粒，在大肠杆菌BL21中观察CFP10-PPE68融合基因的表达，并用亲和层析法分离纯化重组蛋白；用纯化的CFP10-PPE68重组蛋白作为诊断抗原，间接ELISA法检测临床诊断为肺结核病人和肺外结核病人血清标本中相应抗体，并判断其特异性、敏感性和准确性。为结核病的早期诊断提供新的思路。 方法： 1.以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板，用PCR方法分别扩增CFP10和PPE68基因，然后用基因拼接法扩增CFP10-PPE68融合基因，，将其克隆至pET32a(+)载体中，构建重组的原核表达质粒pET32a(+)/CFP10-PPE68，转化至E.coli BL21中，经IPTG诱导表达后，对表达产物进行鉴定。 2.将纯化的CFP10-PPE68重组蛋白作为诊断抗原，间接ELISA法检测临床诊断为肺结核病人（251例）、肺外结核病人（66例）和健康体检者（52例）共369例血清标本中相应抗体，并判断其特异性、敏感性和准确性。 结果： 1．重组的原核表达质粒pET32a(+)/CFP10-PPE68双向测序结果显示与CFP10-PPE68基因编码序列完全一致，表达产物可见相对分子质量约68000的蛋白条带，为CFP10（相对分子质量10900）、PPE68(相对分子质量37330)与Trx-His(相对分子质量20400)的融合蛋白条带。 2.CFP10-PPE68重组蛋白作为诊断抗原，以临床诊断为金标准，52例健康体检者为阴性对照，检测肺结核病人和肺外结核病人结核分枝杆菌感染的敏感性分别为98.4%，98.3%，特异性分别为27.6%，85.0%，准确性分别为56.1%，91.5%。 结论： 1.成功的将结核分枝杆菌特异性基因CFP10、PPE68融合克隆入原核表达质粒pET32a(+)中，并在E.coli BL21中成功表达。 2.CFP10-PPE68蛋白作为诊断抗原，诊断结核分枝杆菌感染，特别是对难以诊断的肺外结核病诊断有一定参考价值。
[Abstract]:Objective:
The construction of Mycobacterium tuberculosis CFP10-PPE68 fusion gene prokaryotic expression plasmid, observe the expression of CFP10-PPE68 fusion gene in Escherichia coli BL21, and purification of recombinant protein by affinity chromatography; the purified CFP10-PPE68 recombinant protein as antigen, clinical diagnosis and detection of indirect ELISA method for the corresponding antibodies in patients with serum samples in patients with pulmonary tuberculosis and pulmonary tuberculosis. And determine its specificity, sensitivity and accuracy. Provide a new method for the early diagnosis of tuberculosis.
Method锛

本文编号：1424330