心脏细胞疗法：致瘤性评估与旁分泌机制探索

发布时间：2018-01-15 11:36

  本文关键词：心脏细胞疗法：致瘤性评估与旁分泌机制探索　出处：《南京医科大学》2012年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：背景： 自从干细胞被发现以来,许多学者致力于研究如何通过干细胞移植治疗各种心脏疾病导致的终末期心力衰竭。近年来,该领域出现了两大重要进展。其一,是出现了新的干细胞来源——诱导的多潜能干细胞(induced pluripotent stem cell, iPS细胞)；其二,是发现了干细胞疗法的新的作用机制——旁分泌机制。本论文分三个部分,分别研究iPS细胞和旁分泌机制在心脏的干细胞疗法中的应用。 由于iPS细胞的重编程诱导过程本身使其具有致瘤可能,因此,要将iPS细胞应用于临床,应警惕其致瘤风险。我们在本文的第一部分评估了经心肌移植未分化iPS细胞在未受免疫抑制的同种异基因受体中是否会形成肿瘤。 越来越多的证据提示,干细胞移植治疗心脏疾病所获得的效果,并非得益于干细胞的原位再生,而是来自于移植细胞通过旁分泌作用对心脏宿主细胞的影响。心肌细胞是心脏中占体积最大的细胞,是心脏功能的主要执行者；心脏成纤维细胞(cardiac fibroblast, CF)是心脏中占数量最多的细胞,在心脏结构重构和电学重构过程中起重要作用。我们在本文的第二部分和第三部分,分别探索了干细胞通过其旁分泌机制,对这两种心脏宿主细胞的作用。 成年哺乳动物的心脏长期以来被认为是终末分化器官。然而,近来发现成年心脏也能够进行心肌细胞更新。因此,细胞衰老可能在心脏衰老的病理过程中起到重要作用。在本文第二部分,我们探索了干细胞是否能够通过旁分泌机制抑制心肌的细胞衰老。 在动物模型中,骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stemcell, BM-MSC)移植能够减弱心脏纤维化；体外研究发现,这种抗纤维化作用可能来自于MSC分泌的旁分泌因子对细胞外基质的直接作用,或来自于MSC通过旁分泌作用抑制CF的增殖并下调其胶原合成能力的间接作用。另外,动物实验和临床研究表明,MSC移植能够维持心脏的电学稳定。为了探索MSC移植改善心脏结构重构和电学重构的机制,我们在本文的第三部分,研究了MSC通过旁分泌对CF的表型、功能与电学特征的影响。 方法： 第一部分中,我们以未受免疫抑制的同种异基因大鼠为受体,其中包括心梗大鼠与正常大鼠,经心肌向其移植大鼠iPS细胞系M13细胞。细胞剂量分别为2×104、2×105和2×106；移植时间分别2、4和6周。我们通过苏木素-伊红染色的组织学检查分析肿瘤形成率和分化情况。 第二部分中,我们收集iPS细胞在正常条件和氧化应激条件下的培养上清液作为大鼠心肌来源细胞系H9c2细胞的条件培养液(conditioned medium,CM)。我们使用经CM处理或无CM处理的H9c2细胞通过缺氧／复氧来诱导其发生细胞衰老。 第三部分中,我们将成人心室成纤维细胞(human cardiac fibroblasts-adult ventricle, HCF-av)进行体外血清饥饿培养,模拟以缺血缺氧为主的心脏病理环境。然后将人类BM-MSC (human BM-MSC, hBM-MSC)与HCF-av进行非接触式共培养,检测hBM-MSC通过旁分泌作用对HCF-av的细胞表型标志物、细胞外基质和缝隙连接蛋白在mRNA水平表达的影响。此外,我们分析了HCF-av钠离子通道和钾离子通道的表达谱及其变化。 结果： 1.未分化的大鼠iPS细胞会在心内和心外区域生成异质性肿瘤。移植的细胞剂量、移植时间以及受体大鼠心梗与否对肿瘤发生率无显著影响。 2.iPS细胞来源的CM能够减弱H9c2细胞中衰老相关p-半乳糖苷酶的活性,降低G1细胞周期阻滞,并减少衰老标志基因p16INK4a、p21Wafl/Cip1和p53的表达。而且iPS来源的CM较H9c2来源的CM含有更高浓度的营养因子。 3. hBM-MSC皂够通过旁分泌作用,上调HCF-av中平滑肌细胞肌动蛋白a (alpha smooth muscle actin, a-SMA)和胸腺细胞分化抗原1(thymocyte differentiation antigen1, THY-1, CD90)的表达；下调多种细胞外基质的表达,包括Ⅰ型胶原、纤连蛋白、腱糖蛋白C、层粘连蛋白和基质金属蛋白酶组织抑制剂1；并下调缝隙蛋白40(Connexin40, CX40)、CX43和CX45的表达。Nav1.5和Nav1.7是HCF-av中表达的主要钠离子通道。其中Nav1.5在病理状态下表达上调, hBM-MSC能通过旁分泌作用抑制这种病理性上调；而Navl.7的表达较稳定。HVF-av表达的主要钾离子通道包括：Kv1.3、Kv1.5、Kv4.2. Kv4.3、Kca1.1、Kca3.1、Kir2.1、Kir2.3、Kir6.1和Kir6.2。它们均在病理状态下表达上调。hBM-MSC能通过旁分泌作用抑制这种病理性上调。Kv7.1、Kv11.1和Kir4.1在HCF-av中无表达或表达很低。 结论： 1.在心脏内行同种异基因移植iPS细胞会导致原位肿瘤形成。此外,从搏动心脏中漏出的细胞可能成为肿瘤播散的潜在来源。 2.iPS细胞分泌的旁分泌因子能够通过抑制p53-p21wafl/Cip1和P16INK4a-pRb通路,延缓H9c2细胞受应激诱导后发生细胞衰老。而雕iPS细胞经受氧化应激后仍能保持上述防细胞衰老的旁分泌作用。 3.MSC移植对心脏结构重构和电学重构的改善,可能是通过其旁分泌效应起作用的,且其具体的作用机制可能包括以下几点：1)减少细胞外基质过量沉积；2)提高CF修补心脏损伤的能力与效率,避免其过量增殖,抑制心脏纤维化；3)减弱CF与心肌细胞的病理性耦联,抑制其对心肌细胞电生理特性的影响；4)恢复CF本身的膜电流特性。 意义： 1.本文首次报道了iPS细胞行同种异基因心肌内移植致肿瘤形成,强调了在将iPS细胞用于心脏疾病的治疗前,应进行严格的安全评估。 2.本文首次报道了干细胞疗法的抗细胞衰老作用,这种作用可能成为治疗衰老相关心血管疾病的崭新治疗策略。 3.本文首次在人类细胞中证明MSC对CF的旁分泌作用；也是首次提出MSC可以通过对CF的旁分泌作用改善心脏的电学重构。
[Abstract]:Background:
Since the stem cells are found, many scholars dedicated to the study of how the stem cell transplantation for the treatment of various heart diseases resulting in end-stage heart failure. In recent years, the emergence of two important progress. One is the emergence of a new source of stem cells, induced pluripotent stem cells (induced pluripotent multi submersible stem cell, iPS cell; second,) is the discovery of the new stem cell therapy mechanism of paracrine mechanism. This paper is divided into three parts, respectively, of iPS cells and secretion mechanism in the next application of stem cell therapy in the heart.
Due to the reprogramming of iPS cells induced by the process itself has the tumorigenic may, therefore, to iPS cells in clinical application, we should be aware of the tumorigenic risk. In the first part of this paper we evaluated the transplantation of undifferentiated iPS cells in allogeneic without immune suppression by whether the formation of tumors in the body.
More and more evidence suggests that stem cell transplantation for the treatment of heart disease result is not due to the in situ regeneration of stem cells, but from the transplanted cells secrete effect on host cells by paracrine. Cardiac myocardial cells is accounted for the largest volume of the cells in the heart, is mainly the implementation of cardiac function; cardiac fibroblast cells (cardiac fibroblast CF) is accounted for the largest number of cells in the heart, play an important role in cardiac structural remodeling and electrical remodeling process. We are in the second part and the third part of this paper, respectively explore the stem cells through paracrine mechanisms of the two kinds of heart host cells.
The adult mammalian heart has long been thought to be terminally differentiated organs. However, recently found that adult heart is also capable of myocardial cell renewal. Therefore, play an important role in the pathological process of cell senescence may be in the heart of aging. In the second part of this paper, we explore whether stem cells through paracrine mechanism of inhibiting myocardial cell aging.
In an animal model of bone marrow mesenchymal stem cells (bone marrow-derived mesenchymal stemcell, BM-MSC) transplantation can attenuate myocardial fibrosis; in vitro, anti fibrosis effect of this may come from the MSC secretion of paracrine factors on extracellular matrix directly, or indirectly from MSC by paracrine inhibition of CF the proliferation and down regulate collagen synthesis ability. In addition, animal experiments and clinical studies showed that MSC transplantation can maintain stable electrical heart. In order to explore the mechanism of MSC transplantation improves cardiac structural remodeling and electrical remodeling, we in the third part of this paper, MSC was studied by paracrine phenotype of CF, affecting the function and electrical characteristics.
Method锛，

本文编号：1428155