应用siRNA干扰技术沉默铜绿假单胞菌外排泵基因mexB的蛋白表达

发布时间：2018-01-15 15:00

  本文关键词：应用siRNA干扰技术沉默铜绿假单胞菌外排泵基因mexB的蛋白表达　出处：《华中科技大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目的： 观察siRNA干扰质粒转入铜绿假单胞菌后， MexB蛋白表达量的变化。 方法： 针对mexB基因设计合成特异性siRNA分子，与pGPU6/GFP/Neo载体连接，构建pGPU6/GFP/Neo-siRNA重组质粒。构建重组表达质粒pET22b+/mexB，，并转化大肠杆菌BL21（DE3）plysS，诱导表达MexB蛋白，蛋白纯化后免疫家兔制备多克隆抗体。siRNA质粒分别电转化铜绿假单胞菌野生株、临床耐药株及mexB基因高表达株，运用western blot观察转化8h、12h、24h后，MexB蛋白表达量的变化。 结果： 成功构建pGPU6/GFP/Neo-siRNA重组质粒。成功表达铜绿假单胞菌外排泵蛋白MexB，并制备多克隆兔抗。siRNA质粒对铜绿假单胞菌野生菌、临床耐药株及mexB基因高表达株的mexB基因均具有良好的沉默效果，而且沉默效果存在时间差异性。 结论： siRNA质粒转化三株铜绿假单胞菌后，在8h及12h时均可观察到MexB蛋白表达量明显减少，而在24h时MexB蛋白表达量无改变。其原因可能是由于细菌内存在限制性核酸内切酶，能降解异源DNA，这一机制可能导致转入细菌内的siRNA重组质粒被迅速降解，使基因沉默时间缩短。
[Abstract]:Objective: To observe the change of MexB protein expression after siRNA interference plasmid was transferred into Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas aeruginosa). Methods: The specific siRNA molecule was designed and synthesized for mexB gene and was linked to pGPU6/GFP/Neo vector. Construction of pGPU6/GFP/Neo-siRNA recombinant plasmid, construction of recombinant expression plasmid pET22b / mexB, and transformation of Escherichia coli BL21(DE3)plysS. MexB protein was induced and purified and the polyclonal antibody. SiRNA plasmids were prepared by electrotransformation of Pseudomonas aeruginosa wild-strain, clinically resistant strain and high expression strain of mexB gene. Western blot was used to observe the expression of MexB protein. Results: The recombinant plasmid of pGPU6/GFP/Neo-siRNA was successfully constructed and the efflux pump protein MexB of Pseudomonas aeruginosa was successfully expressed. The polyclonal rabbit anti-. siRNA plasmid had good silencing effect on mexB gene of Pseudomonas aeruginosa, clinical resistant strain and high expression strain of mexB gene. And silence effect exists time difference. Conclusion: After three strains of Pseudomonas aeruginosa were transformed with siRNA plasmid, the expression of MexB protein was significantly decreased at 8h and 12h. However, the expression of MexB protein did not change at 24 h, which may be due to the existence of restriction endonuclease in bacteria, which can degrade heterologous DNA. This mechanism may lead to the rapid degradation of siRNA recombinant plasmid transformed into bacteria and shorten the gene silencing time.
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R378.991;Q78

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本文编号：1428832