用于组织工程骨成骨机制研究的小鼠模型的建立及其初步应用

发布时间：2018-01-16 07:32

本文关键词：用于组织工程骨成骨机制研究的小鼠模型的建立及其初步应用　出处：《第三军医大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景：临床上因骨肿瘤、骨关节结核需手术广泛切除，高能量创伤、化脓性骨关节炎等因素所致的大段骨缺损十分常见，以间充质干细胞（MSC）为种子细胞构建的组织工程骨被公认为修复大节段骨缺损最有希望的策略之一。组织工程骨修复骨缺损的大量实验研究着重放在最终的成骨效果和推进临床前研究，而对于组织工程骨构成要素之一的种子细胞的作用机制研究鲜有涉及，既往有些研究者推测，种子细胞MSCs在体内主要是通过直接分化成骨来弥补宿主成骨能力的不足，从而促进骨缺损的修复，而在我们前期的研究中将骨组织工程的种子细胞MSCs通过绿色荧光标记后进行体内示踪，发现移植的MSCs虽可以参与成骨，但是在新生骨组织中大量的是宿主来源的成骨相关细胞，这提示有大量的宿主细胞迁移到组织工程骨移植部位参与成骨，因此我们提出种子细胞可能的修复机制：组织工程骨被移植到骨缺损部位后，局部创伤产生了炎症，而释放的炎症因子刺激了种子细胞与宿主早期炎症浸润的单核细胞，它们产生了趋化因子和细胞因子，驱使宿主的成骨相关细胞募集迁移而来。动物模型是骨组织工程研究必要的载体，纵观目前用于组织工程骨研究的各种动物模型，虽各有其优势但并不适合用于组织工程骨成骨机制的相关研究。目的：(1)制备简便易行的小鼠股骨干骨缺损模型，可用于骨组织工程机理研究；(2)MSCs作为种子细胞体外复合DBM材料构建组织工程骨，观察细胞在材料上的增殖、分化情况；(3)将构建好的组织工程骨移植到小鼠骨缺损模型上，观察种子细胞的迁移和转归情况，验证模型的科学性和可行性。方法：(1) MicroCT测量分析小鼠股骨的解剖参数。将30只2～3月龄FVB/N品系的小鼠分成3组，每组10只，用我们自行设计的内固定物固定后分别制备长度为1mm、2mm和2.5mm的股骨干中段骨和骨膜缺损模型，术后不同时相点通过影像学和组织学的方法来观察骨缺损的愈合进程。(2)采用全骨髓细胞贴壁法分离培养小鼠骨髓间充质干细胞，通过细胞表面的特异抗原标志物和多向分化潜能来鉴定。(3)根据本实验室成熟的构建方法，将绿色荧光小鼠的骨髓间充质干细胞(mBMSCs)作为种子细胞同猪DBM构建组织工程骨，扫描电镜和激光共聚焦观察细胞在DBM材料上的增殖、分化情况。(4)将普通型小鼠骨髓间充质干细胞复合DBM材料构建的组织工程骨移植到绿色荧光小鼠双侧股骨干骨缺损模型上，两侧分别植入TEB和单纯DBM材料进行对照，利用小动物活体成像系统分别于术后第3天，7天，10天进行观察，观察后将两侧标本块上的细胞消化下来行流式细胞仪分选和计数，对比两组之间的差异，评价种子细胞是否募集了更多的宿主细胞参与局部骨缺损的修复，进一步验证模型的有效性。结果：(1)通过测量得到小鼠股骨的解剖参数：股骨长度（15.48±0.73）mm；股骨干中部横径（1.38±0.20）mm；矢状径（2.05±0.05）mm；髓腔直径（0.75±0.80）mm,除去股骨髁和小转子以上的部分，股骨干长度为8.5mm。建模术后第7、28、56、84天分别对实验小鼠进行钼靶X线拍摄观察，可见骨缺损长度为1mm的实验组：骨缺损术后第7d内固定位置良好，骨缺损两断端对位对线良好，缺损端清晰锐利；骨缺损术后第28d内固定物固定牢靠无移位，骨缺损端有纤维骨痂形成；第56d骨缺损处可见形成大量的骨痂，骨痂密度高；骨缺损术后第84d骨缺损处已有连续性骨痂通过，达到临床愈合。骨缺损长度为2mm的实验组：术后第28d内固定位置好，骨缺损端折线变得模糊；术后第84d骨缺损断端变得圆钝，骨痂生长不明显。缺损长度为2.5mm的实验组：骨缺损术后连续观察，内固定位置良好，骨断端无成角、短缩移位。术后84d，缺损处无明显骨痂生长，断端折线显示较为锐利，可见类似软组织影充填。组织学观察术后84d，HE染色结果显示，骨缺损长度为1mm的实验组缺损处可见大量的新生骨小梁组织填充，髓腔再通；骨缺损长度为2mm的实验组可见在一侧的缺损骨端有少量成骨，缺损处纤维组织充填，纤维组织与骨端的边界清楚；骨缺损长度为2.5mm的实验组可见缺损处充填着大量的纤维结缔组织，无骨组织生成。(2)采用全骨髓细胞贴壁法分离的小鼠骨髓间充质干细胞，镜下可见贴壁生长，呈典型的成纤维细胞形态，流式细胞仪检测所培养第二代小鼠MSCs的细胞表型：MSCs特异性抗原CD105高表达（92.7%）；造血系抗原CD34和CD45低表达；内皮细胞系抗原CD31低表达；病理特殊染色证实细胞具有向成骨、成脂分化的能力。(3)FVB/N品系的小鼠的骨髓间充质干细胞，将其同猪DBM材料体外构建TEB，通过激光共聚焦成像技术和扫描电镜技术观察到细胞种植到DBM材料上以后，随着时间的推移，细胞增殖分化良好，能够在材料的表面和孔隙内紧密贴附并伸出突触，荧光强度逐渐增强，细胞呈成纤维细胞形态。(4)构建双侧小鼠股骨缺损模型，无一例失败，术后3d的股骨标本大体观无明显差异，荧光成像观察TEB组和DBM组股骨缺损处几乎看不到绿色荧光；术后7d观察股骨缺损处材料块上两组都有大量的细胞基质，荧光成像可见TEB组和DBM组股骨缺损处局部可见明显的绿色荧光表达，TEB组较DBM组荧光表达稍强。术后10d股骨标本大体观察两组均可见缺损处材料上可见有纤维肉芽组织覆盖，荧光成像显示两组股骨缺损处局部均具有显著的荧光表达，，TEB组与DBM组对比荧光明显较强烈，表明移植术后10d，TEB组较单纯DBM组骨缺损处有更多宿主来源的绿色荧光细胞。小动物成像观察结束后立即将材料块上的细胞消化下来进行流式细胞分选和计数，表明术后7天和10天，TEB实验组相比单纯DBM组，表达绿色荧光的细胞量显著较多。结论：(1)构建的小鼠股骨干骨缺损模型在不填充任何材料的情况下，1mm的实验组能过通过自身修复愈合，而2mm以上的实验性骨缺损在术后3个月牢靠固定的情况下仍不能自行愈合，符合临界骨缺损的标准，能够满足我们后续的实验需求。(2)采用全骨髓细胞贴壁的方法分离培养的小鼠骨髓间充质干细胞具有良好的增殖分化潜能，通过表面标记物以及多向分化潜能鉴定证实是实验所需的骨髓间充质干细胞，(3)DBM材料具有天然的三维网孔骨结构，大孔隙内部虽有大量小孔隙相互连通，但孔径仍相对较大，扫描电镜图像测量DBM的孔隙率约为76%，DBM材料具有良好的细胞相容性和孔隙率，细胞能够在材料的表面和孔隙内增殖分化良好，荧光标记的细胞强度逐渐增强。(4)将FVB/N品系野生型小鼠的骨髓间充质干细胞构建的组织工程骨和单纯DBM支架材料移植到同品系绿色荧光小鼠双侧股骨缺损模型上，术后不同时相点，通过小动物成像技术、流式细胞分选等方法证明种子细胞MSCs能够募集更多的宿主细胞参与骨缺损的修复，初步证实了该模型用于组织工程机制研究的可行性。
[Abstract]:Background : In clinic , the bone defects are common in bone tumor , osteoarticular tuberculosis requiring extensive resection , high energy trauma , suppurative osteoarthritis , etc . The bone graft in the bone graft is recognized as one of the most promising strategies for repairing segmental bone defects . Objective : ( 1 ) To prepare a simple and easy - to - do mouse femoral diaphysis defect model , which can be used in the research of bone tissue engineering mechanism ; ( 2 ) MSCs were used as seed cells in vitro to construct the tissue engineering bone , observe the proliferation and differentiation of the cells on the material ; ( 3 ) the constructed tissue engineering bone was transplanted into the mouse bone defect model , and the migration and transformation of the seed cells were observed , and the scientific nature and feasibility of the model were verified . Methods : ( 1 ) MicroCT was used to measure the anatomic parameters of bone defects in mice . Thirty rats 2 - 3 months old FVB / N strain were divided into three groups . Results : ( 1 ) In the experimental group , the length of the bone defect was 2 mm . ( 4 ) There was no significant difference between the two groups of bone defects in both groups . There was a significant difference in the fluorescence intensity of TEB group and the bone defect group . The fluorescence imaging showed that there were more host - derived green fluorescent cells in both the TEB group and the experimental group . Conclusion : ( 2 ) The bone marrow mesenchymal stem cells with bone marrow mesenchymal stem cells in the wild type of FVB / N strain have good cell compatibility and porosity .

【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R681;R-332

【参考文献】