流体剪切应力作用强度对内皮细胞Fractalkine表达水平的影响
本文关键词：流体剪切应力作用强度对内皮细胞Fractalkine表达水平的影响 出处：《新疆医科大学》2012年硕士论文 论文类型：学位论文
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【摘要】：目的：动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）是多种心脑血管疾病的基础，血液流动产生的剪切应力对内皮细胞形态和功能的影响在心血管系统疾病中起重要作用。在内皮细胞，已发现多种受剪切应力调节的基因，包括趋化因子。Fractalkine（FKN）是已发现的趋化因子CX3C亚家族仅有成员，，因兼有趋化和粘附的特殊性，与多种炎症性疾病相关，并且在体研究发现低剪切应力诱导形成的AS斑块处FKN表达增加，大量研究也表明FKN对于AS的形成和发展具有重要意义。方法：1.原代脐静脉内皮细胞的培养：在新鲜（健康剖宫产产妇分娩后立即取新生胎儿脐带，长度15-20cm，取标本时间≤4小时）脐静脉内注0.1%的Ⅱ型胶原酶消化获得内皮细胞，用M199生长液（含25%内皮细胞上涨因子，ECGS）进行培养，EA.HY926细胞株用M199生长液(无含ECGS)进行培养。为更合理的选择研究对象，比较两组细胞的光学显微镜及电子显微镜下形态、Ⅷ因子相关抗原免疫组化、细胞纯度检测CD31抗体表达及两种细胞的增长曲线。结果：⑴光学显微镜下形态观察：原代HUVEC体外生长3～4d可铺满单层,细胞呈梭形、饱满，漩涡状排列生长,传代后可见管腔样结构； EA.HY926细胞株胞质多颗粒，2～3可铺满单层，可长成复层。⑵免疫组化结果分析：用Image-Pro Plus6.0软件判断Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色结果，原代HUVEC的平均光密度为4138.8±594.01，EA.HY926细胞株的平均光密度为2234.02±78.78，T检验得出P㩳O.O1，两者平均光密度差别有统计学意义，原代HUVEC的染色程度明显比EA.HY926细胞株高。⑶电子显微镜下形态观察：透射电镜下，原代HUVEC里可发现较多的横切与纵切的Webel-Palade小体，在EA.HY926细胞株较少。⑷细胞纯度检测：CD31抗体的表达率原代HUVEC细胞(85.36%)大于EA.HY926细胞株(70.82%)，进行t检验，P㩳0.001，两种细胞CD31表达差异有统计学意义，原代HUVEC高于EA.HY926细胞株。⑸原代细胞从48小时开始进入生长期，96小时达到高峰后，细胞开始衰老，趋向凋亡。EA.HY926细胞株48h开始进入生长期，96-120h达到高峰后，进入稳定生长，生长幅度较小。结论：脐静脉注Ⅱ型胶原酶消化法配合M199生长液（含25%ECGS）可迅速获取大量内皮细胞,其生物学特性明显优于EA.HY926细胞株,而细胞株由于细胞数量多，培养方法简单，成活率高为特点，选用于较复杂，细胞创伤较大的研究。2.为阐明内皮细胞Fractalkine mRNA及蛋白表达与剪切应力强度的关系，我们用不同强度的流体剪切应力(2.62，4.58，6.54，10.47，15.71，19.64dyne/cm2)处理培养的EA.HY926人脐静脉内皮细胞株，然后采用荧光定量RT-PCR的方法检测内皮细胞FractalkinemRNA的表达量，采用双抗体夹心ABC-ELISA技术检测内皮细胞Fractalkine蛋白质的生成。结果：荧光定量FKN mRNA表达量，未处理组基础表达量极少，为0.01±0.00，在剪切应力4.58dyne/cm2时的表达量最高，为1.92±0.22，进行单因素的方差分析，六组不同剪切应力之间总P＜0.05，4.58dyne/cm2与其余组的相差比较均为P＜0.05，差别有统计学意义。为了证明剪切应力强度与Fractalkine mRNA表达量之间的相关性，进行两组相关性分析，结果r=-0.35，p＞0.05，两组数据没有相关性。ELISA法测定Fractalkine的蛋白表达量，未处理组基础表达量极少，为0.016±0.00，剪切应力4.58dyne/cm2时的Fractalkine蛋白表达量最高，为0.15±0.04，进行单因素方差分析均与其他剪切应力下的蛋白表达量差异有统计学意义。为了证明剪切应力强度与Fractalkine蛋白表达量之间的相关性，进行两组相关性分析，结果r=-0.33，p＞0.05，两组数据没有相关性。结论：此结果提示剪切应力诱导Fractalkine最佳强度为4.58dyne/cm2，根据此强度可进一步研究Fractalkine基因表达与作用时间的关系。流体低剪切应力诱导内皮细胞Fractalkine mRNA的表达增高，可能在炎症和动脉粥样硬化的发生、发展过程中具有重要作用。
[Abstract]:Objective : To investigate the effects of shear stress on the morphology and function of endothelial cells ( ECGS ) on endothelial cells . In order to demonstrate the relationship between the shear stress intensity and the expression of fractalkine mRNA , the results showed that the expression of talkine mRNA and protein in the untreated group was significantly higher than that of EA - HY926 cell line .
【学位授予单位】：新疆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R331
【参考文献】
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